上海理工大学医疗器械与食品学院
上海理工大学研究生院 常务副院长
艾连中，上海理工大学研究生院常务副院长、医疗器械与食品学院教授/博导、上海食品微生物工程技术研究中心主任，中国食品科学技术学会理事及青年委员会主任委员、中国畜产品加工研究会理事。入选国家“万人计划”科技创新领军人才、国家百千万人才工程，国务院政府特贴专家、教育部新世纪优秀人才等人才计划。从事食品优良微生物选育与利用、乳制品的研究与开发、多糖的结构与功能等方面的研究工作，主持“973”计划课题等科研项目20余项；获得省部级以上科技奖励11项；获得授权发明专利46 项；发表科研论文180余篇，SCI收录80余篇；参编英文专着2部。
报告题目
乳酸菌CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建及应用
摘 要
乳酸菌基因功能和代谢途径解析需要高效精确的基因操作工具，但常规的基因操作工具依赖于两次同源重组，基因操作方法耗时费力。本研究基于CRISPR技术，建立了乳酸菌CRISPR-Cas9、CRISPR-nCas9和CRISPR-dCas9高效基因编辑系统。针对干酪乳杆菌中传统同源重组方法效率低问题，构建了CRISPR-nCas9单质粒基因编辑工具pLCNICK。pLCNICK利用启动子P23和Pldh分别启动Cas9D10A突变体和sgRNA的转录，并同时提供目标基因的同源臂作为DNA修复的供体。利用该方法，实现干酪乳杆菌LC2W4 个基因LC2W_1326、LC2W_1628、LC2W_2179和LC2W_2189的无痕敲除及GFP基因在LC2W_1628位点的插入，基因编辑效率达到25%～62%。利用此系统对胞外多糖（EPS）合成关键基因无痕敲除，鉴定出EPS合成关键蛋白Wzx（翻转酶）、Wzz（链长决定蛋白）、Wzy（多糖聚合酶）、PCP（多糖共聚合酶）和OPX（多糖转运蛋白），揭示了干酪乳杆菌EPS合成调控机制。针对植物乳杆菌存在同源修复缺陷，导致自身对双链DNA缺口无法进行有效修复问题，构建了RecE/T修复的CRISPR-Cas9双质粒基因编辑工具。将噬菌体衍生的RecE/T修复系统与CRISPR-Cas9结合，通过转录活性筛选出广宿主强启动子，建立一个重组辅助质粒和广宿主CRISPR-Cas9编辑质粒的通用工具，在植物乳杆菌中实现高效的基因组编辑。该系统的基因敲除效率达到50%～100%，敲除周期为7 d。同时，丙酮酸盐脱羧酶原位替换Lp_0537的效率可达35.7%。此外，针对乳酸乳球菌功能解析缺乏有效基因抑制方法，构建了CRISPR-dCas双质粒基因编辑工具。通过报告系统筛选出诱导型启动子，结合dCas实现对目标基因的转录抑制。利用该系统分别对upp，BSH及SOD进行单基因或多基因转录抑制，基因表达抑制率可达40%～99%。总之，本研究为乳酸菌提供了一套高效的基因编辑系统，为乳酸菌的功能机制解析等基础研究奠定基础。
