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黄曲霉毒素B₁酶联免疫定量测试盒使用说明书  本测试盒利用固相酶联免疫吸附（ELISA）原理，通过抗黄曲霉毒素B₁抗体与酶标抗原、待测抗原的竞争免疫反应以及酶的催化显色反应相结合来检测黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁，AFB₁），适用于各类食品、原粮及其制品、饲料及相关原料中AFB₁的定量检测，特点是灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读。一、测试盒组成

1、包被抗体的反应板	48/24/12 孔
2、A试剂:样品稀释液	1瓶
3、B试剂：AFB1标准溶液	1套（0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL）
4、C试剂：酶标抗原	2/1/1瓶
5、D试剂：酶标抗原稀释液	1瓶
6、E试剂：浓缩洗涤液	1瓶
7、F试剂：显色底物液a	1瓶
8、G试剂：显色底物液b	1瓶
9、H试剂：终止液	1瓶
10、反应板框架	1块

 附：样品稀释液（A试剂）的配制方法：（1）先配制PBS缓冲液（pH7.4）：3.0g Na₂HPO₄·12H₂O, 0.25g Na₂HPO₄·2H₂O, 8.7g NaCl定容至1000mL。可根据实验需要按比例配制。 （2）品稀释液（A试剂）：取100mL甲醇，加入900mL PBS缓冲液（pH7.4），混匀即得样品稀释液。可根据实验需按比例配制。 1二、实验准备1、 样品处理：详见“样品处理方法”。2、 试剂的配制（1）每瓶C试剂（酶标抗原）中准确加入1.5mL D试剂（酶标抗原稀释液），充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2～8℃保存。（2）取适量E试剂（浓缩洗涤液）用蒸馏水稀释20倍待用。例如：取3mL E试剂（浓缩洗涤液），加57mL 蒸馏水，混匀后制成实验用洗涤液，足够24孔使用。三、实验步骤1、 试剂平衡：将测试盒于室温中放置15min 以上，平衡至室温。2、小孔编号：根据实验需要截取相应孔数放置反应板框架上。设定1号孔为仪器调零孔，2—7号孔为AFB₁标准对照孔，其余孔为样品孔。3、洗涤：每孔加入250μL左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置1min 后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次。4、反应组成：按下列步骤所示（见表1），依次加入配制好的溶液及待测样液。第一步：1号孔加入50μL A试剂（样品稀释液）,2—7号孔分别加入系列的B试剂（AFB₁标准溶液：0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL）50μL，其余孔加入相应待测样液。    第二步：1号孔加入50μL D试剂（酶标抗原稀释液），其余各孔均加入50μL C试剂（酶标抗原溶液）。    第三步：轻轻地振摇，使各孔中的反应物混匀。表1   反应物组成

操作次序	加入量	孔       号
		1   2   3   4   5    6   7   8   9   10   11 12
1 2 3	50μL 50μL	A   0 0.1 0.25 0.5 1   2    …   待测样液…… D   C   C   C   C    C   C   C  C    C   C    C 混   匀

25、反应：将反应板放入37℃恒温培养箱中孵育30min。6、洗涤：取出反应板，用力甩掉反应液，拍干。每孔加入250μL 左右洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2min 后，甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次。7、显色：每孔分别加入F试剂（显色底物液a）和G试剂（显色底物液b）各50μL，摇匀，将反应板放入37℃恒温培养箱中显色15min。8、终止与仪器测定：每孔分别加入H试剂（终止液）50μL，摇匀后用酶标测定仪（或黄曲霉毒素B₁专用测定仪）在450nm波长处测定各孔的吸光度A值。9、样品定量计算：将系列的AFB₁标准溶液（0，0.1，0.25，0.5，1，2ng/mL）测得的吸光度A值，绘制成标准曲线（见示意图）。横坐标为标准液浓度的常用对数值（lgC），纵坐标为各标准液孔A值与0ng/mL 标准液孔的A值的比值即（A_{（标准液）}）/A_（0ng/mL））。黄曲霉毒素B₁标准曲线示意图（注：示意图仅供参考）3计算待测样品孔A值与A_（0ng/mL）的比值（A_{（标准液）}）/A_（0ng/mL）），查标准曲线，可得到相应待测样液浓度（C）的常用对数值lgC，对其求反对数，可求得待测样液的AFB₁浓度C。按下列公式计算出样品中AFB₁的含量：

V m

 

AFB₁的含量（ng/g）= C ×      × D式中：C：待测样品液中AFB₁的含量（ng/mL）V：样品提取液体积（mL）m：样品质量（g）D：样品稀释倍数（见表2）四、测试盒储存1、2～8℃ 存储，忌0℃ 以下动存。 2、有效期6个月。五、AFB₁国家允许量标准请参阅表2。六、相关检测依据：【GB/T5009.22-2003，GB/T17480-1998,AOAC-IUPAC方法（JAOAC72.326（1989）】。七、批号：见测试盒。