【产品名称】通用名称:大肠杆菌O157:H7 核酸扩增(PCR)检测试剂盒英文名称:Nucleic acid amplification (PCR) diagnostic kit for
E. coli O157:H7 DNA
【包装规格】20次/盒
【预期用途】用于食品、饮用水、临床样品以及环境样品中的大肠杆菌O157:H7的检测。试剂盒可以同时检测大肠杆菌O157:H7的O抗原、H抗原,以及毒素基因
stx1和
stx2,共计4个靶基因。
【检验原理】试剂盒使用大肠杆菌O157:H7的O抗原特异引物和H抗原特异引物,可与样本中的大肠杆菌O157:H7基因组的相应靶位点特异性结合,利用PCR反应达到对大肠杆菌O157:H7快速检测的目的。试剂盒具有特异性强的特点,可以将大肠杆菌O157:H7从其它大肠杆菌O血清型中区分出来。
stx1和
stx2是O157:H7的毒力基因,是判断菌株致病力强度的重要因素,试剂盒使用了
stx1及
stx2基因的特异引物检测被测菌是否具有产生毒素的能力。
【主要组成部分】 大肠杆菌O157:H7 核酸扩增(PCR)检测试剂盒 | 组份 | 规格 | 数量 | 贮存温度 |
大肠杆菌O157:H7 PCR反应液 | 500μl /支 | 1支 | -20℃ |
rTaq酶 | 12μl /支 | 1支 |
核酸提取液 | 1ml/支 | 2支 |
大肠杆菌O157:H7阳性对照品 | 35μl /支 | 1支 |
阴性对照品 | 100μl /支 | 1支 |
【储藏条件及有效期】 -20℃保存
,避免反复冻融,有效期一年。
【适用仪器】普通PCR仪
【样品处理】(1)取培养后的菌液约1.5ml,12000rpm离心2min,去上清。(2)加入200μl无菌水,充分混匀,12000rpm离心2min,去上清。(3)加入80μl核酸提取液,用移液器吹吸混匀,50℃水浴1小时,100℃水浴15分钟,冰上放置10分钟后12000rpm离心3min。(4)取上清液用于PCR检测。
【使用方法】1. 试剂配制(试剂准备区)从试剂盒中取出PCR反应液在室温融化,将PCR浓缩液充分震荡混匀,所有试剂在使用前2000rpm离心10s。设所需要的管数n(n=样本数+1管阳性对照品+1管阴性对照品),每个测试反应体系试剂配置如下表。计算所需要的n管反应的各试剂的使用量,加入至适当体积的无菌离心管中,充分混合均匀,分装至无菌PCR反应管中,每管25μl。
| PCR反应液 | Taq酶 |
每个反应体系试剂用量 | 24.7μl | 0.3μl |
2. PCR扩增(扩增和产物分析区)将样本、阴性对照品和阳性对照品使用前恢复至室温,2000rpm离心10s。向每个PCR反应管中分别加入样本、阴性对照品和阳性对照品各5μl,震荡混匀,于2000rpm离心10s。将PCR管放入PCR仪中,使用以下程序进行扩增反应,整个扩增反应约需2小时:
Step 1 95℃ 5min Step 2 95℃ 30s Step 3 55℃ 45s 35 个循环
Step 4 72℃ 60s Step 5 72℃ 5min3. 结果判断(扩增和产物分析区)从PCR管中取出2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外灯下观察到861bp条带即为大肠杆菌O157阳性,观察到349bp条带即为大肠杆菌H7阳性,观察到246bp条带即为毒力基因
stx1阳性,观察到666bp条带即为毒力基因
stx2阳性。反之,未出现条带或所出现的条带大小与以上4条特异条带大小不同即为阴性结果。阴性对照品结果应为阴性,阳性对照品结果应出现以上4条特异大小条带。
【注意事项】1. 实验前请仔细阅读本说明书。
2. 本试剂盒不做临床诊断。
3. 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范,试验人员必须进行专业培训,实验过程中严格分区进行(试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区),实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备,各区用品不能交叉使用。
4. 样本准备和试剂准备阶段应使用生物安全柜,实验过程中穿工作服,带一次性手套,使用自卸管移液器。
5. 对每次实验进行质量控制。
6. 试剂使用前要完全解冻,并混合均匀,但应避免反复冻融。
7. 样本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器,并与废弃物一起灭菌后方可丢弃。
8. 实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。
9. 所有检测样品应视为具有传染性物质,操作和处理均需符合相关法规要求:卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。