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一种基于多重实时荧光聚合酶链式反应熔解曲线分析的肉及肉制品掺假鉴别方法

放大字体  缩小字体 发布日期:2017-09-07
核心提示:近年来国内外肉类掺假事件频发,巨大的价格差异驱动着一些不法经营者以低价肉替代高价肉而未在标签上注明来降低成本。这不仅严重侵害了消费者利益,而且更严重的是造成恶劣的社会影响,对整个肉类产业也会造成巨大伤害,因此急需开发可靠的真伪鉴别技术,保护消费者权益和肉类产业健康发展。
   近年来国内外肉类掺假事件频发,巨大的价格差异驱动着一些不法经营者以低价肉替代高价肉而未在标签上注明来降低成本。这不仅严重侵害了消费者利益,而且更严重的是造成恶劣的社会影响,对整个肉类产业也会造成巨大伤害,因此急需开发可靠的真伪鉴别技术,保护消费者权益和肉类产业健康发展。
 
  由于引物设计方法局限和多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系间干扰等因素,现有文献报道能同时检测的成分数多为5 个及以下且检出限较高。来自中国肉类食品综合研究中心的周彤、李家鹏、李金春等人,应用引物的简并性设计,即寻找遗传相近的物种(鸡鸭、狗狐貉、山羊、绵羊等)通用而与其他物种特异的DNA序列来设计引物,实现不增加聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)反应重数的前提下,提高可检测物种的种类,开发一种基于5重RT-PCR熔解曲线分析的肉及肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9 种源性成分的同步鉴别方法,为相关部门提供可靠的技术手段和执法依据,具有巨大的市场需求和广阔的应用前景。
 
  结果与分析
 
  1
 
  引物特异性检验
 
  分别使用猪、牛、羊、鸡鸭、狗狐貉及5 对特异性引物的混合体系对提取好的猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、鹿、鱼、狐狸、貉子、马、猫、驴、鼠15 个物种DNA(稀释到相同质量浓度5 ng/μL)进行RT-PCR检测。5 对引物均表现出了良好的特异性,只对测试引物相对应的物种产生阳性特异性扩增,而对其他物种在30 个循环内无典型扩增曲线出现。5 对引物混合后对各物种DNA的多重PCR检测扩增曲线结果与单一引物检测相同,这为开发完整的基于多重RT-PCR熔解曲线分析的掺假检测技提供理论依据。
 
  不同物种组合的样品(混合样品中各肉种成分比例相同),采用5重RT-PCR体系对各样品进行检测和熔解曲线分析,进一步验证方法体系的特异性,同时确定各物种成分特异性熔解峰的Tm值范围。所有样品出现熔解峰的位置均与样品已知肉种组成相符,未出现非特异性扩增,表明方法具有较好的特异性,多重RT-PCR熔解曲线图谱中各源性成分Tm值的分布范围分别为:绵羊源性成分Tm值(71.8±0.6)℃,山羊源性成分Tm值(73.3±0.4)℃,牛源性成分Tm值(74.7±0.7)℃,狗、狐狸、貉源性成分Tm值(77.2±0.9)℃,猪源性成分Tm值(80.8±0.5)℃,鸡源性成分Tm值(85.1±0.4)℃,鸭源性成分Tm值(87.4±0.2)℃。
 
  2
 
  方法的灵敏度检验结果
 
  将10、1、0.1、0.01、0.001 ng猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子9 个肉种DNA样品及猪、牛、绵羊、鸭、狐狸混合DNA样品,进行5重RT-PCR及熔解曲线分析,检测本方法灵敏度。采用本方法体系检测多物种混合DNA,猪、牛、羊、狐狸、鸭5 种源性成分的检出限均为0.1 ng。
 
  3
 
  市售肉类样品检测
 
  为了进一步考察本方法的准确性和实际应用性,对100 份随机采集的市售肉类样品进行检测,结果表明,Tm值在(71.8±0.6)℃范围内出现熔解峰(绵羊源性成分)的有18 份样品;Tm值在(73.3±0.4)℃范围内出现熔解峰(山羊源性成分)的有3 份样品;Tm值在(74.7±0.7)℃范围内出现熔解峰(牛源性成分)的有50 份样品;Tm值在(80.8±0.5)℃范围内出现熔解峰(猪源性成分)的有28 份样品;Tm值在(85.1±0.4)℃范围内出现熔解峰(鸡源性成分)的有10 份样品;Tm值在(87.4±0.2)℃范围内出现熔解峰(鸭源性成分)的有10 份样品。
 
  生肉片肉卷、酱卤肉制品、肉串、干制品、香肠和火腿制品等各类肉制品中均存在掺假情况,掺假率达27.0%,其中肉串类食品掺假最为严重,掺假率高达40.7 %,大多采用鸡、鸭等低价肉种替代或掺假。上述结果表明,该方法可以用于实际样品(包括生鲜样品和熟肉样品)掺假的快速鉴别。
 
  结  论
 
  本研究建立的一种基于5重RT-PCR熔解曲线分析的肉及肉制品掺假鉴别方法,可以准确的同时检测肉及肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐、貉9 种源性成分。该方法具有良好的特异性及灵敏度,可用于实际样品(包括生鲜样品和熟肉样品)掺假鉴别,大幅降低了检测成本,提高了检测效率和准确率,对加强肉类市场监管、有效抵御肉制品掺假,保护消费者和相关肉制品企业利益是十分重要的,为相关部门提供可靠的技术手段和执法依据,具有巨大市场需求和广阔的应用前景。
 
 
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