本次比较的3种鉴定系统
Vitek 2 Compact
全自动微生物鉴定系统（简称Vitek 2 Compact）
MicroScan WalkAway 96 plus
全自动微生物鉴定系统（简称MicroScan WalkAway 96 plus）
MALDI-TOF MS
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry，简称MALDI-TOF MS）
本研究将这3种鉴定系统对室间质评质控菌株鉴定结果进行回顾性分析，以便了解仪器的性能，使之在日常工作中发挥更好的作用。
· 材料 ·
1.菌株来源：
2013—2016年国家卫生计生委临床检验中心发放的60份样本61株质控菌（其中编号1408的样本为2种细菌的混合菌样本）
其中革兰阴性杆菌26株（肠杆菌科13株、非发酵菌8株、弧菌科5株）、革兰阳性球菌15株（葡萄球菌属5株、肠球菌属3株、链球菌属6株、孪生球菌属1株）、酵母样真菌8株（念珠菌属7株、隐球菌属1株）、其他细菌12株（厌氧菌1株、苛养菌4株、革兰阳性杆菌7株）。
2.仪器
Vitek 2 Compact及配套的GN、GP、YBC、NH和ANC鉴定卡购自法国生物梅里埃公司。
MicroScan Walk Away 96Plus及配套的NC50、PC33、Y-ID、HNID和ANID鉴定卡购自德国Siemens公司。
MALDI Biotyper系统、校准品和α-氰基-4-羟基肉桂酸均购自德国布鲁克-道尔顿公司。
3.质控校准菌株
MALDITOF MS校准株为大肠埃希菌DH5α。Vitek 2 Compact和MicroScan WalkAway 96 plus质控菌株为金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）和白念珠菌（ATCC 10231），由上海市临床检验中心提供。
4.其他试剂：
三氟乙酸、色谱级乙腈、乙醇、甲酸。
沙门菌属、志贺菌属诊断血清
羊血琼脂平板、伊红美蓝平板、SS琼脂平板、巧克力平板及沙保弱平板。
· 方法 ·
1.菌种准备
按照《全国临床检验操作规程》（第4版），根据样本来源将菌株选择性接种于羊血琼脂平板、伊红美蓝平板、SS琼脂平板、巧克力平板及沙保弱平板等培养基上，置35 ℃孵育18～24 h。
2. Vitek 2 Compact鉴定
挑取单个菌落，鉴定根据菌落形态、革兰染色性、生长特性，按照仪器说明书配置一定浓度的菌悬液，接种相应的鉴定卡，上机进行鉴定。
3. MicroScan WalkAway 96 plus鉴定
根据菌落形态、革兰染色性、氧化酶、触酶和凝固酶试验结果，按照仪器说明书配置一定浓度的菌悬液，接种相应的鉴定卡，上机进行鉴定。
4. MALDI-TOF MS分析
用1 μL接种环直接挑取单个菌落涂抹在金属靶板上，滴加1 μL基质液（50%乙腈与2.5%三氟乙酸混合配制的饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液），室温晾干后将靶板放入MALDI-TOF MS仪检测。
将大肠埃希菌DH5α的蛋白抽提液作为蛋白校准品用于仪器的校准和阳性对照。每次实验前用校准品进行质量校正，校正完毕采集质谱图数据。
仪器参数设置：正线性操作模式，相对分子质量范围为2 000～20 000，加速电压为20 kV，提取电压为16.7 kV，聚焦电压为6.5 kV，提取延迟时间为120 ns。使用Flex Control 3.0软件采集图谱，使用BrukerBiotyper 3.0软件将图谱数据与标准数据库进行比对，得分>1.7的结果为可接受的鉴定结果，得分<1.7则表示无法给出可靠的鉴定结果。
5. 血清凝集试验
沙门菌、志贺菌的血清凝集试验具体操作方法见《全国临床检验操作规程》（第4版）。
· 结果 ·
1. 61株质控菌株的鉴定
MALDI-TOF MS、Vitek 2 Compact和MicroScan WalkAway 96 Plus对61株质控菌株鉴定的总准确率分别为95.1%（58/61）、96.7%（59/61）和77.9%（47/61）。
2. 26株革兰氏阴性杆菌的鉴定
MALDI-TOF MS鉴定的准确率为88.4%，20株（76.9%）直接鉴定到种，3株（11.5%）需进一步血清学验证，3株（11.5%）鉴定错误，其中肠杆菌科细菌的鉴定准确率为76.9%，非发酵菌和弧菌科细菌的鉴定准确率均为100.0%。
Vitek 2 Compact的鉴定准确率为100.0%，20株（76.9%）直接鉴定到种，6株（23.1%）需进一步血清学验证或生化鉴定。
MicroScan WalkAway 96 plus的鉴定准确率为84.6%，18株（69.2%）直接鉴定到种，4株（15.4%）需进一步血清学验证或生化鉴定，3株（11.5%）未能鉴定，1株（3.8%）鉴定错误，其中肠杆菌科细菌的鉴定准确率为100.0%，非发酵菌和弧菌科细菌的鉴定准确率分别为75.0%和60.0%，见表1。
3. 15株革兰式阳性球菌的鉴定
MALDI-TOF MS的鉴定准确率为100.0%，14株（93.3%）直接鉴定到种，1株（6.7%）需进一步鉴定。
Vitek 2 Compact的鉴定准确率为100.0%，全部直接鉴定到种。
MicroScan WalkAway 96 plus的鉴定准确率为86.7%，11株（73.3%）直接鉴定到种，2株（13.3%）需进一步生化鉴定，2株（13.3%）未能鉴定。
其中，MALDI-TOF MS给出的肺炎链球菌（编号1405）鉴定结果为肺炎链球菌/口腔链球菌/缓症链球菌，软件系统提示加做奥普托欣试验进行鉴别；牛链球菌（编号1610）鉴定结果的细菌名称是解末食子酸链球菌解末食子酸亚种，是牛链球菌的一个亚种。
对链球菌属细菌的鉴定准确率为83.3%，由于铅黄肠球菌和醇鸡肠球菌的生化反应十分相似，该系统无法区分，给出的鉴定结果为醇鸡/铅黄肠球菌，只有通过人工菌落色素和溶血现象的观察进行区分。见表2。
4. 8株酵母样真菌的鉴定
MALDI-TOF MS和Vitek 2 Compact的鉴定准确率均为100.0%，均全部直接鉴定到种。
MicroScan WalkAway 96 plus的鉴定准确率为87.5%，7株（87.5%）直接鉴定到种，1株（12.5%）鉴定错误。见表3。
5. 12株其他种类细菌的鉴定
MALDI-TOF MS的鉴定准确率为100.0%，全部直接鉴定到种。
Vitek 2 Compact的鉴定准确率为83.3%，10株（83.3%）直接正确鉴定到种，2株（16.7%）未能鉴定，其中对革兰阳性杆菌的鉴定准确率为71.4%。
MicroScan WalkAway 96 plus的鉴定准确率为41.7%，只有3株（25.0%）直接正确鉴定到种，2株（16.7%）需进一步生化鉴定，1株（6.7%）鉴定错误，6株（40.0%）未能鉴定，其中苛氧菌和革兰阳性杆菌的鉴定准确率分别为50.0%和28.6%。见表4。
· 讨论 ·
1.三者对常见菌属及肠杆菌科细菌的鉴定准确性比较
2.MALDI-TOF MS将3株志贺菌属细菌错误鉴定成大肠埃希菌
MALDI-TOF MS将3株志贺菌属细菌（编号1311、1412、1611）错误地鉴定成大肠埃希菌，主要原因是志贺菌属在遗传学上属于大肠埃希菌种，在MALDI-TOFMS数据库中缺乏志贺菌属的数据，这种结果在不少文献中有相关报道。
因此，在日常工作中，尤其是在查找沙门菌、志贺菌的粪便样本时，一定要根据菌落形态，结合常规的生化反应结果进行判断，再以血清学试验结果为最终的鉴定结果。
3.三个系统对沙门菌属均只能鉴定到属
对于沙门菌属，3个系统都只能鉴定到属，需用血清学试验进一步验证。虽然Vitek 2 Compact和MicroScan WalkAway 96 plus对部分沙门菌和志贺菌如甲型副伤寒沙门菌（编号1308）、肠炎沙门菌亚利桑那亚种（编号1402）、宋内志贺菌（编号1611）可以直接鉴定到种，但仍需以血清凝集试验结果为准，以防判读错误。
Vitek 2 Compact和MicroScan WalkAway 96 plus是依据细菌生化反应的鉴定系统，对于一些生长缓慢、生化反应多数为阴性的细菌而言，很难直接鉴定到种。当系统给出2个鉴定结果时，需要一些辅助试验加以区分。
4.三者对非发酵菌、弧菌科、苛养菌、革兰氏阳性杆菌的鉴定准确率比对
MALDI-TOFMS在革兰阳性杆菌鉴定方面展现出明显的优势。Vitek2 Compact和MicroScan WalkAway 96 plus由于数据库原因，导致某些细菌如解脲棒状杆菌（编号1609）只能被鉴定到棒状杆菌属，对于一些不常见的疑难菌株如奴卡菌属，或鉴定错误，或显示无法鉴定。
此次采用3种鉴定系统对质控菌株进行鉴定、比对，部分属的菌株数较少，尚需做进一步的大样本分析。
通过室间质评活动，我们对这3个鉴定系统的性能有了深入的认识和掌握，3种鉴定系统都存在局限性，用户应根据自身日常需要进行相应系统的选择。
同时我们还要做好室内质量控制工作：
（1）待检测的菌株必须进行纯培养；
（2）观察菌落的形态和溶血情况，做好氧化酶、触酶初步生化反应，选择正确的鉴定卡；
（3）规范操作，避免菌液、加样枪的污染；
（4）保证鉴定卡和试剂在有效期内。
