生物指示剂与鉴定
生物指示剂是一类含有活微生物的特殊测试制品[1]，在药厂的质控实验室很常用，可确认灭菌设备的性能、验证灭菌程序、监控生产过程和灭菌效果等，一般用于灭菌验证的都是这些微生物的孢子。
本文我们所探讨的对象是嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus），在《中国药典》1421章节当中按照曾用名嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）称呼，被用作湿热灭菌法和气体灭菌法的生物指示剂。最早于1917年在罐头豆角和玉米中被发现[2]。
在后续的研究中，人们对Bacillus属的细菌进行了各种深入的研究，按照rRNA的亲缘关系对种系发育群分为7个新的属，并进行命名[3]。其中Geobacillus成为具有嗜热性、兼性厌氧、能降解烃和产生表面活性剂的新属。
一般来说，用嗜热脂肪地芽孢杆菌制备的生物指示剂产品，在CoA中会包含对其进行微生物鉴定结果的说明。但按照《中国药典》9203章节中的建议，大部分药品微生物实验室仍规定对所收到的生物指示剂进行鉴定和验收。
建立合理的鉴定SOP是关键
在《中国药典》9204章节中有非常明晰的叙述，鉴定的步骤包含了前期的分离纯化、初步筛选和后续的核心鉴定。所以建立一个适用于生物指示剂的鉴定SOP，首要地一定要摸索出合适的分离纯化条件。
考虑到Geobacillus属为专性嗜热菌，其最适宜的生长温度为55-65℃[4]，因此笔者将预摸索的阶段的分纯温度设置为57.5℃。
在严苛的制药环境中，Geobacillus很容易在细胞中产生内生芽孢，然而VITEK 2的鉴定试卡是依赖生理生化反应来进行表型判断的，需要控制芽孢的产生和尽可能分离到营养体，因此预摸索的分纯培养基选择了胰酶大豆胨平皿（TSA）和哥伦比亚羊血平皿（COS），分纯时间24h。两组培养基在菌落形态上并无十分明显的差异，但相比于对照组（分纯48h）新鲜菌落的鉴定结果更好。
因此笔者将推荐将SOP的条件控制为：将破坏结构的生物指示剂菌悬液添加到营养培养基上进行四区划线，60℃左右培养24h，挑取第四区内典型单菌落制备成1.8-2.2McF的菌悬液，接种至VITEK 2 BCL试卡。
生物指示剂鉴定百分率（ID%）的接受限
按照预摸索所得的SOP进行操作，可得到Geobacillus stearothermophilus的种鉴定结果，鉴定评价“好的鉴定”，鉴定百分率为91%。
按照目前国际上的公认，嗜热脂肪地芽孢杆菌的模式菌株为DSM 22T（即ATCC 12980T）[5]。但考虑在极热环境下的特殊的功能基因和特种酶，供应商往往选择非模式菌株ATCC 7953（即NCTC 10007）来制备生物指示剂，这也是VITEK 2系统中其鉴定百分率值不在“极好的鉴定”范围内的原因。
由此可见，对于生物指示剂所选择的微生物特性有了较明确的认知后，就能合理地选择条件制定鉴定SOP，得到满意的实验室结果。
