一、实验步骤
1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后,碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤,依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜,无菌操作下取出胚胎放入预冷的 D-Hanks’平衡盐液中。
2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层,除去脑膜,剪碎组织成约1mm3 大小,加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱内消化20 min,中间摇晃一次。
3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM+10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。
4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的 DMEM+10%FBS 的离心管内,用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次,静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤 2~3 次。
5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。
6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min,弃上清,管内加入新鲜培养液(DMEM+20%FBS)并吹打 成单细胞悬液。
7. 细胞计数,调整细胞密度按1.5×105/cm2 种入6 孔板内,放入CO2 孵箱中培养。培养48 h 后换液并 加入Ara-C使其终浓度为 1×10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量换液。以后每隔 3 天半量换液一次。
注意事项:
1. 上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动:如消化时可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右,也可用 DNA 酶进行消化,有人还直接进行吹打,都可行。
2. 上面虽然时大鼠皮层神经元,但是同样适用于小鼠,但是应该选择孕13 d 左右的小鼠。
3. 神经元是一种比较难培养的细胞,因此在接种时细胞的密度一定要够。