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草苁蓉多糖对氧化应激所致血管内皮细胞凋亡的抑制作用

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-07-25
核心提示:血管内皮细胞覆盖于血管内壁表面的单层扁平或多角形的细胞,具有调节血流、参与物质交换、调节血压、抑制血小板聚集及血栓形成等功能,其损伤是引起高血压和动脉粥样硬化等心脑血管疾病发病的关键因素。
   血管内皮细胞覆盖于血管内壁表面的单层扁平或多角形的细胞,具有调节血流、参与物质交换、调节血压、抑制血小板聚集及血栓形成等功能,其损伤是引起高血压和动脉粥样硬化等心脑血管疾病发病的关键因素。草苁蓉为列当科草苁蓉属多年生寄生性草本植物,具有延年益寿、滋补强身、补肾壮阳以及润肠止血等功效。草苁蓉多糖(BRPS)是草苁蓉的重要活性成分,无毒且具有抗高脂血症和免疫增强等功能。但目前为止,BRPS对血管内皮细胞损伤的保护作用尚不清楚。
 
  来自延边大学附属医院的崔香丹、朱洁波和延边大学医学院的何鑫采用tBHP诱导血管内皮细胞氧化损伤模型,探讨BRPS对血管内皮细胞氧化损伤以及凋亡的抑制作用,旨在为草苁蓉的开发利用提供科学依据。
 
  1BRPS对HUVEC的毒性
 
  BRPS质量浓度小于等于100 mg/L时,HUVEC存活率均大于90%,与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05),不显示细胞毒性。因此,本研究选取100、50、25 mg/L作为BRPS干预剂量进行后续研究。
 
  2BRPS对tBHP损伤HUVEC存活率的影响
 
  与正常组比较,tBHP损伤组HUVEC存活率显着降低(P<0.05),为(49.4±4.1)%;而BRPS 高、中和低剂量组HUVEC 存活率分别为(71.3±11.2)%、(60.8±7.3)%和(54.3±3.2)%,与损伤组比较升高44.3%、23.1%和9.9%,差异显着(P<0.05)。提示BRPS预处理能抑制tBHP所致HUVEC氧化应激损伤。
 
  3BRPS对tBHP损伤HUVEC ROS水平的影响
 
  与正常组比较,损伤组细胞产生强绿色荧光,荧光强度增高44 倍,提示细胞内ROS水平升高;而BRPS高、中和低剂量组细胞则产生微弱绿色荧光,与损伤组比较荧光强度分别下降93.1%、82.2%和64.6%,差异显着(P<0.05);且随BRPS质量浓度的升高,荧光强度呈减弱趋势;提示BRPS预处理降低细胞内ROS水平。
 
  4BRPS对HUVEC MDA、GSH、SOD水平的影响
 
  与正常组比较,损伤组内皮细胞SOD活力和GSH含量显着降低(P<0.05),MDA水平显着升高(P<0.05);与损伤组比较,BRPS组内皮细胞SOD活力与GSH含量显着升高(P<0.05),MDA水平显着降低(P<0.05),提示BRPS预处理可上调HUVEC抗氧化防御能力。
 
  5BRPS对HUVEC ΔΨm的影响
 
  与正常组比较,损伤组内皮细胞ΔΨm降低;与损伤组比较,BRPS组细胞ΔΨm增高,随BRPS剂量的升高,红色荧光呈增强趋势;绿色荧光呈减弱趋势;提示BRPS抑制tBHP所致HUVEC ΔΨm的下降。
 
  6HUVEC Hoechst33342染色结果
 
  正常组细胞蓝色荧光弱,染色均匀弥散,细胞数量较多。损伤组细胞荧光强,细胞数量明显减少,可见细胞核发生固缩、核内呈颗粒状明亮蓝色荧光,出现明显凋亡特征。BRPS组细胞核内颗粒状明亮蓝色荧光呈逐渐减弱趋势,大部分细胞蓝色荧光均匀弥散,接近正常组细胞特征。
 
  7BRPS对HUVEC凋亡的影响
 
  正常组几乎看不到凋亡细胞;损伤组部分细胞出现核固缩等早期凋亡特征,与正常组比较,凋亡细胞明显增多;与损伤组比较,BRPS组凋亡细胞明显减少,BRPS高、中和低剂量组荧光强度分别下降59.1%、46.9%和32.5%,差异显着(P<0.05);且随BRPS剂量的升高呈递减趋势。提示BRPS抑制tBHP所致HUVEC凋亡。
 
  8BRPS对HUVEC Caspase活化的影响
 
  与正常组比较,损伤组细胞Caspase活化片段Cleaved caspase3(Cleaved c3)、Cleaved caspase(Cleaved c8)和Cleaved caspase9(Cleaved c9)表达显着升高(P<0.05),分别为正常组的2.8、2.1 倍和3.0 倍;与损伤组比较,BRPS组细胞Caspase活化片段Cleaved c3、Cleaved c8、Cleaved c9表达显着降低(P<0.05),其中BRPS高剂量组中各活化片段的表达分别下降70.6%、45.9%和47.2%,提示BRPS抑制tBHP所致HUVEC Caspase的活化,从而抑制HUVEC凋亡。
 
  9BRPS对HUVEC胞浆Cyt c蛋白表达的影响
 
  与正常组比较,损伤组HUVEC胞浆Cytc蛋白水平显着升高(P<0.05),为正常组的5.4 倍;与损伤组比较,BRPS组HUVEC胞浆Cyt c蛋白水平显着下降(P<0.05),BRPS高、中和低剂量组中分别下降71.4%、69.4%和22.4%;提示BRPS减少tBHP所致HUVEC线粒体Cyt c的释放,抑制Caspase依赖的HUVEC凋亡。
 
  10BRPS对HUVEC Bcl-2、Bax和Bid蛋白表达的影响
 
  与正常组比较,损伤组细胞Bax蛋白表达上调1.5 倍,Bcl-2蛋白表达下调0.5 倍,Bax/Bcl-2比值升高2.8 倍,线粒体tBid水平升高1.1 倍,差异均显着(P<0.05);与损伤组比较,BRPS高、中和低剂量组细胞Bax相对表达量分别降低57.1%、44.3%和19.0%,Bcl-2相对表达量分别升高136.4%、27.3%和9.1%,Bax/Bcl-2比值分别下降81.9%、56.3%和25.8%,线粒体tBid水平分别下降45.5%、44.5%和36.4%,差异显着(P<0.05),提示BRPS可通过阻止Bid活化以及降低Bax/Bcl-2比值而抑制HUVEC凋亡。
 
  结  论
 
  BRPS提高tBHP损伤的内皮细胞存活率,降低细胞ROS水平,减少MDA生成,提高SOD活性与GSH水平,升高ΔΨm水平,抑制细胞凋亡。Western blot结果显示,BRPS降低胞浆Cyt c、线粒体tBid水平,减小细胞Bax/Bcl-2比值,抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化。结论:BRPS对氧化应激所致血管内皮细胞凋亡具有抑制作用,机制可能与线粒体凋亡途径和死亡受体途径均有关。
 
 
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