国内关于CAP的残留ELISA检测试剂盒的研发,主要集中在间接ELISA试剂盒,仅有少数是直接竞争法ELISA试剂盒;直接竞争法ELISA采用的包被原有羊抗兔IgG抗体(二抗)和CAP单克隆抗体。广东省食品质量与安全重点实验室,畜禽产品精准加工与安全控制技术国家地方联合工程研究中心的刘 姚、韦倩妮、王 弘等人在已获得高特异性CAP单克隆抗体的基础上,对CAP直接竞争ELISA方法进行优化,为进一步研制蜂蜜中CAP残留直接竞争ELISA检测试剂盒提供理论依据。
1、最佳反应条件
标准品稀释液的确定
使用蒸馏水或者PB溶液配制标准溶液进行ELISA实验时,A450 nm值偏低,而用PBS或PBST可提高A450 nm值,且使用PBS时,IC50值低而Amax/IC50高,可能原因是PBS溶液具有一定离子强度,有较好的缓冲能力,使用其作为标准品稀释液进行ELISA反应时,不会破坏缓冲体系的pH值和离子浓度,因此选择PBS稀释标准品检测效果最佳。
包被温度的确定
采用4 ℃包被过夜,A450 nm值和Amax/IC50较高,并且比37 ℃包被更灵敏。抗体在37 ℃包被过程中,由于孵育时间偏长,部分蛋白变性,而4 ℃长时间孵育更有利与抗体充分吸附到固相载体上并保持抗体活性,因此选择4 ℃为最佳的包被温度。
包被抗体稀释倍数的确定
当包被抗体稀释倍数达到1∶4 000时,随着稀释倍数的提高,曲线灵敏度并没有明显变化,但A450 nm值和Amax/IC50值逐渐降低,因此,选择1∶4 000作为包被抗体最佳稀释倍数。
酶标抗原稀释液的确定
用PBST稀释酶标记抗原,其检测值较低,但灵敏度和Amax/IC50最高,而其余2 种稀释液效果相当,可能原因是PBST的成分对于非特异性蛋白的竞争性结合的抑制作用更为明显,故选择PBST作为抗体稀释缓冲液。
酶标抗原稀释倍数的确定
随着酶标记抗原稀释倍数的提高,A450 nm值和IC50值降低,Amax/IC50升高。当稀释倍数达到1∶4 000时,各个参数达最佳水平。因此酶标记抗原最佳稀释倍数为1∶4 000。
竞争时间的确定
随着竞争时间延长,检测值随时间的延长呈平稳上升趋势,Amax/IC50先升高再降低,在25 min处达到最高值。IC50值变化较为显着,在20~20 min内IC50值较低,但此后随竞争时间延长,IC50值急剧升高。因此ELISA反应最佳竞争时间为25 min。
标准曲线的建立
根据波长450 nm处吸光度,以CAP标准品质量浓度负对数为横坐标,以A450 nm为纵坐标,绘制标准曲线。标准曲线的回归方程为y=-17.425x+97.509,相关系数R2为0.991 2,IC50为0.63 ng/mL。线性范围(IC20~IC80)为0.10~4.17 ng/mL。
2、样品前处理方法的优化
提取方式的确定结果
采用超声提取和振荡提取2 种方式提取样品中的CAP,提取得率相差不大。振荡提取更为简便,因此确定振荡提取为样品前处理方式。
提取时间的确定结果
不同提取时间条件下,样品的添加回收率均在90%~120%之间。5 min已可将样品中的CAP几乎完全提取出来。组织样品等其他样品的基质成分较蜂蜜更为复杂,为确保尽可能完全提取出各类样品中的CAP,又不至于使处理时间过长,故选择提取时间为10 min。
3、方法确证
蜂蜜样品中CAP的检出限和定量限结果
按照ELISA条件优化结果,本实验选取20 份空白蜂蜜样品,按照直接竞争ELISA方法测定。蜂蜜样品的检出限和定量限分别为0.15 ng/g和0.33 ng/g。
准确度结果
选取3 个添加水平,分别为0.3、1 ng/g和3 ng/g,其回收率分别为100.94%、100.81%和97.58%,且批间和批内变异系数均小于11%,表明该方法准确度高。
精密度结果
当CAP质量浓度为0.1 ng/mL时,变异较大,当质量浓度在0.3~8.1 ng/mL范围内,变异系数均小于10%,表明该方法重复性较好。
讨 论
本实验对CAP标准品稀释液、包被温度、包被抗体稀释倍数、酶标抗原稀释液、酶标抗原稀释倍数和竞争时间6 个单因素进行优化,建立最优CAP直接竞争ELISA方法,优化后的反应条件为:包被抗体稀释倍数1∶4 000,包被温度4 ℃,酶标记抗原稀释缓冲液为PBST,稀释倍数1∶4 000,最佳竞争时间25 min。在此条件下,建立的ELISA方法检出限可达(0.04±0.01) ng/mL,检测范围为0.10~4.17 ng/mL,检测反应时间需要40 min左右,满足国内外规定的CAP检出限。同时蜂蜜空白样品的检出限和定量限分别是0.15 ng/g和0.33 ng/g,回收率分别为97.58%、100.81%和100.94%,满足实际检测的需要。与前人CAP直接竞争ELISA检测方法相比,本研究所建立的方法检测限更低、检测反应过程耗时更短。