01
质量控制
1.实验过程中,每批样品前增菌液、选择性增菌液、分离平板等都要做空白对照。如果空白对照平板上出现志贺菌可疑菌落时,应废弃本次实验结果,并对增菌液、吸管、平皿、培养基、实验环境等进行污染来源分析。
2.定期使用福氏志贺菌CMCC51571菌种或相应定量活菌参考品,在二级生物安全实验室或阳性对照实验室内,用适当的食品样品进行阳性对照实验验证,染菌剂量应控制在10~100CFU/25g样品,并进行记录。
3.将所使用的培养基和生化试剂用GB4789.28-2013推荐的阳性和阴性对照标准菌种进行验证,并进行记录。
02
操作要点与注意事项
1.使用均质袋进行前增菌培养时,应使用带有底托的均质袋架子,防止培养过程中前增菌液泄露污染培养箱。
2.在进行TSI培养时,应将试管口松开,保持管内有充足的氧气,否则会产生过量的H2S。由于三糖铁琼脂试验中底部的糖分解要厌氧环境,琼脂底部与斜面最低点的距离应不少于4厘米。
3.在培养箱中,为防止中间平皿过热,高度不得超过6个平皿。
4.本方法移液时可使用可连续吸液的电动移液器,在使用过程中,一旦液体进入电动移液器膜中,应立即对滤膜进行更换,以防止交叉污染。
5.当对易产生较大颗粒的样品(如肉类)进行检测时,建议使用带滤网均质袋,以方便均质后用吸管吸取匀液。
6.鉴于微量移液器移液头较短,为控制污染,在本方法移液过程中不应使用。
7.如使用厌氧罐培养时,应放置厌氧指示剂,监控整个培养期间的厌氧环境。
8.如果典型可疑菌落与其他杂菌连成一片,应自每个琼脂平板上分别用接种针自菌落中心挑取2个典型或可疑志贺菌菌落,接种于XLD或志贺菌显色平板上进行分离纯化,于36℃±1℃培养20~24h,得到单个典型或可疑志贺菌菌落,以便进行下一步生化试验。
9.进行氨基酸脱羧酶实验时,在实验管和氮基酸对照管中滴加菌液后需分别向各管中滴加2~3滴液体石蜡,进行液封。因为某些菌在特定氨基酸存在情况下,诱导产生相应氨基酸脱羧酶,使氨基酸脱羧,产生一种碱性物质一一尸胺,而该物质在厌氧条件下可稳定存在,使得培养基环境pH升高,克服培养基本身的酸性环境以及葡萄糖代谢产生的酸,从而使培养基呈蓝绿色(指示剂为溴麝香草酚蓝)或紫色(指示剂为溴甲酚紫);而对照管中不含氨基酸,菌株利用葡萄糖产酸,培养基环境pH下降,使得培养基变黄。滴加液体石蜡主要目的是创造厌氧环境,并防止酸挥发。
10.由于某些不活泼的大肠埃希菌与志贺菌在显色平板上的菌落特征相似，部分生化特性也相似,因此建议采用多种鉴定方法来支撑试验结果的准确性。
03
疑难解析
问题1. 对厌氧罐和厌氧袋进行密封性能和厌氧状态的检查主要有哪些方法?
指示剂法:①选择配套的指示剂,按照商品说明书,根据指示剂在有氧和无氧条件下的变化确定厌氧罐的密封情况和罐内氧气的状态。②选择硫乙醇酸盐流体培养基,作为氧化还原指示剂。该培养基中含有刃天青,在有氧情况下呈现红色,无氧情况下呈黄色。
生物指示剂法:培养严格厌氧菌(如生孢梭苗)或严格好氧菌(如铜绿假单胞菌),以生长或不生长来指示。
问题2. 放入冰箱中的培养基颜色会发生变化,为什么?
培养基保存于4℃冰箱中,培养基内CO2会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性,而培养基中酸碱指示剂的颜色也会随碱性变化面变化。
问题3. 50%甘油-BHI肉汤菌种冻存液知何配五和使用?
取BHI肉汤干粉,按说明书加入1/2体积的水彻底溶解后,再加入等体积的甘油,混匀,分装于2mL菌种冻存管中(1.5mL/管),121℃高压灭菌15min,-20℃储存备用。使用时,将BHI肉汤冻存存管从-20℃取出,恢复至室温,将已鉴定完成的志贺菌用无菌棉签从营养琼平板上刮取,加入50%甘油-BHI肉汤中,混匀,用防冻记号笔标清晰,-80℃长期保存备查。
