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关于ChIP必须知道的

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-01-11
核心提示:染色质免疫沉淀(ChIP)用于分析基因组中特定染色体区域中组蛋白乙酰化状态的实验方法,被用来研究细胞内DNA与蛋白质相互作用。是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。
   染色质免疫沉淀(ChIP)用于分析基因组中特定染色体区域中组蛋白乙酰化状态的实验方法,被用来研究细胞内DNA与蛋白质相互作用。是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。
 
  为什么要用甲醛交联?
 
  甲醛交联是 ChIP 实验非常关键的一个步骤。因为甲醛交联能更好的保存蛋白与 DNA 的相互作用,除了用于检测组蛋白修饰分布的 Native ChIP 以外,其他的 ChIP 基本上都需要用甲醛交联。
 
  交联注意事项:
 
  1.甲醛交联用到的甲醛浓度和交联时间都是有严格要求的。一般的甲醛交联都选用 1% 的甲醛浓度,室温固定 10~15 分钟。时间太短的话,交联反应进行的不彻底,很多蛋白与 DNA 的结合不是很牢固,交联时间太长的话,会导致后续超声非常困难,而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构,进而导致 ChIP 结果不理想。
 
  2.在甲醛交联之前,细胞需要尽可能少被人为处理。如果条件允许的话,直接将甲醛加入培养基或将细胞培养基吸弃并换成含有 1% 甲醛的 PBS 交联会比胰酶消化细胞以后再交联更好一些。
 
  3.甲醛交联反应结束之后,需要马上加入相对甲醛过量的甘氨酸(一般甘氨酸终浓度为 125 mM)与甲醛反应,终止交联反应。
 
  4.终止交联之后,样本需要经过 PBS 清洗(如果细胞数量比较少的话,可以在 PBS 里加入 0.1%~0.5% NP-40,这样细胞在转移时不会粘在管壁或培养皿上),细胞沉淀可以直接用液氮速冻,然后置于 -80 摄氏度长期保存。
 
  5.细胞交联之前确保细胞生长状态,细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络,也很有可能影响所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般而言,细胞密度长到75%-80%比较好。
 
  6.组织的交联相比细胞交联要复杂一些。虽然甲醛可以很容易的透过细胞,但是大的组织块还是不太容易交联的很均一,所以大的组织块交联之前需要切成小块。一般建议用两个刀片将组织块切成 1~3 mm3 大小。组织的交联时间一般可以延长到 15 min,这样能保证组织的充分交联。
 
  7.抗体的选择一定慎重!单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。单抗和多抗两种抗体各有利弊。单抗特异性强,背景低。但是单抗有一个弱点,就是识别位点单一,而在ChIP甲醛交联的过程中,很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭,导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题,但是多抗特异性较差,背景可能会偏高。
 
  8.操作时,尽可能的保持低温(4度)。沉淀的时候可以先在4度放置一会,等它自然沉降一些,再超低转速(500 rpm等)离心使其完全沉降。虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方,但最好还是能够连续把它做完,直到PCR结果出来为止,尽量避免实验中不可预知的影响因素。
 
 
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