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干酪乳杆菌胞外多糖诱导小鼠骨髓来源树突细胞成熟以及分泌IL-6、TGF-β和IL-23

放大字体  缩小字体 发布日期:2019-05-15
核心提示:乳酸菌胞外多糖(LAB EPS)是乳酸菌发酵过程中的产物之一,在改善发酵乳制品的质构特性、流变学特性和风味方面具有重要作用,也在生物活性方面发挥着重要作用。
   乳酸菌胞外多糖(LAB EPS)是乳酸菌发酵过程中的产物之一,在改善发酵乳制品的质构特性、流变学特性和风味方面具有重要作用,也在生物活性方面发挥着重要作用。一些研究者已经报道了LAB EPS的抗肿瘤、抗氧化、调节消化道、免疫调节活性等多种生物学活性。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)作为乳酸菌中的一种,被广泛应用在乳制品发酵中。近年来的研究表明,益生菌发酵乳长时间干预机体可以提高肠黏膜免疫系统中树突细胞(DCs)的数量,而EPS作为发酵产品中重要的生物活性成分,可能发挥一定作用。对于L. casei EPS在促进未成熟DCs向成熟DCs转化方面的研究鲜见报道,也鲜见其诱导成熟后的DCs分泌与T细胞向辅助性T细胞(Th)17分化增殖相关的细胞因子的研究报道。
 
  来自东北农业大学食品学院乳品科学教育部重点实验室的任琦琦、任皓威、杨翠翠、刘宁*通过流式细胞法检测L. casei EPS处理后体外培养的小鼠未成熟BMDCs表面表达MHC II和CD86的情况,研究L. casei EPS对体外培养的小鼠BMDCs促成熟的作用,用酶联免疫吸附检测(ELISA)法分析不同剂量的EPS对BMDCs分泌与Th17细胞分化和增殖相关的细胞因子白细胞介素(IL)-6、转化生长因子-β(TGF-β)和IL-23的影响,为进一步探讨L. casei EPS通过影响DCs分泌细胞因子来影响初始型T细胞的分化方向提供依据。最后0,用CCK-8法检测混合培养体系中异基因淋巴细胞的增殖率,研究L. casei EPS对BMDCs抗原提呈能力的影响。
 
  1、多糖纯度的测定分析
 
  葡萄糖标准曲线的回归方程为y=-0.0166+8.92x(R2=0.99954)。490 nm波长处测得0.1 mg/mL EPS样品溶液的OD值,将其代入葡萄糖标准曲线回归方程中,得出0.1 mg/mL EPS样品溶液中总糖质量浓度为(0.09502±0.00146)mg/mL,可以推算出1 mg EPS冻干粉中的总糖质量为(0.9502±0.0146)mg,即L. casei EPS纯度可达95%。紫外分光光度计检测EPS中蛋白质和核酸含量,发现在280、260 nm波长处没有吸收,表明EPS样品中蛋白质、核酸的含量极少,说明纯化的EPS在研究中的活性作用不受蛋白质和核酸的影响。
 
  2、诱导出BMDCs的鉴定
 
  流式细胞仪分析出的表达CD11c的细胞数量约占80%,表明通过骨髓造血干细胞分化出的未成熟DCs数量约占80%。
 
  3、EPS对BMDCs成熟的影响
 
  3.1 EPS对BMDCs表达MHC II的影响
 
  PBS组的DCs表面MHC II类分子的表达量为63.8%,而100 μg/mL EPS组和LPS组的表达量分别为68.1%和70.2%。结果表明,EPS能显着增加DCs表面MHC II分子的表达(P<0.05),并且EPS组的MHC II分子表达量低于LPS组。证明EPS能够促进BMDCs表面表达更多的MHC II类分子,EPS对BMDCs的成熟有促进作用。
 
  3.2 EPS对BMDCs表达CD86的影响
 
  PBS组的DCs表面共刺激分子CD86的表达量为68.5%,而100 μg/mL EPS组和LPS组的表达量分别为74.3%和75.1%。结果表明,EPS能提高DCs表面共刺激分子CD86的表达(P<0.05),并且EPS组CD86的表达量低于LPS组。证明EPS能够促进BMDCs表面表达更多的CD86分子,EPS对BMDCs的成熟有促进作用。DCs刺激初始T细胞活化和增殖的一个信号是共刺激信号,通过DCs上的CD80/CD86和T细胞上的CD28的相互作用来传递,因此可以推测EPS对于DCs刺激初始T细胞活化和增殖也有相应的促进作用。
 
  4、EPS对DCs分泌与Th17细胞分化增殖相关的细胞因子的影响
 
  当EPS质量浓度为12.5~200 μg/mL时,均能够显着促进BMDCs表达IL-6,EPS组的IL-6表达量分别为(93.18±0.62)、(96.21±0.62)、(100.51±1.56)、(101.77±0.94)、(104.55±0.62)ng/L,与PBS组表达量(40.66±1.89)ng/L相比具有极显着性差异(P<0.01),并且IL-6表达量与EPS的质量浓度呈正相关,当EPS质量浓度为200 μg/mL时,IL-6的表达量最多。值得注意的是,EPS组与LPS组((107.50±1.24)ng/L)相比,IL-6的表达量显着减少(P<0.05)。当EPS质量浓度为12.5~200 μg/mL时,均能够极显着促进BMDCs分泌TGF-β,EPS组的TGF-β 表达量分别为(87.56±1.00)、(91.63±0.57)、(92.85±2.87)、(99.35±1.52)、(104.23±2.51)ng /L,各EPS组表达量与PBS组((61.95±1.99)ng/L)相比均有极显着差异(P<0.01),并且EPS质量浓度与促进BMDCs分泌TGF-β的量呈正相关,当EPS质量浓度为200 μg/mL时,TGF-β的表达量最多。LPS组TGF-β表达量为(115.05±1.49)ng/L,EPS组与之相比,TGF-β的表达量极显着减少(P<0.01)。当EPS质量浓度为12.5~200 μg/mL时, 均能够极显着促进BMDCs分泌IL-23,EPS组IL-23表达量分别为(152.22±2.58)、(152.73±3.71)、(159.30±3.78)、(163.84±1.43)、(168.38±3.78)pg/mL,与PBS组的表达量(82.53±3.78)pg/mL相比差异极显着(P<0.01),并且IL-23表达量与EPS质量浓度呈正相关,当EPS质量浓度为200 μg/mL时,IL-23的表达量最多。值得注意的是,EPS组与LPS组IL-23的分泌量(179.22±1.20)pg/mL相比,IL-23的表达量极显着减少(P<0.01)。以上结果表明,一定质量浓度的EPS能够促进DCs分泌IL-6、TGF-β和IL-23,并且呈剂量依赖性,说明EPS可以通过促进DCs分泌IL-6和TGF-β来促进初始T细胞向Th17细胞方向分化,分泌IL-23促进Th17细胞的增殖。
 
  5、EPS影响BMDCs对异基因淋巴细胞增殖的刺激作用
 
  EPS质量浓度为25~200 μg/mL实验组的淋巴细胞增殖率与阴性对照组相比显着增多(P<0.05),与阳性对照组相比显着减少(P<0.05),表明EPS提高了异基因淋巴细胞的增殖能力,说明EPS能够增加BMDCs的抗原提呈能力。实验组的淋巴细胞增殖率随着EPS质量浓度的增加呈上升趋势,但是50 μg/mL EPS与25 μg/mL EPS组的淋巴细胞增殖率相比未显着增加,25 μg/mL EPS与12.5 μg/mL EPS组的淋巴细胞增殖率相比未显着增加,而100 μg/mL EPS和200 μg/mL EPS组与其他实验组的淋巴细胞增殖率相比增加显着(P<0.05),但是这两个实验组的淋巴细胞增殖率相比没有显着性差异,表明100、200 μg/mL EPS更有利于淋巴细胞增殖,且促进效果相当。
 
  结 论
 
  分离出EPS的纯度约为95%;EPS能够上调BMDCs表面MHC II和CD86的表达量;EPS可以显着促进BMDCs分泌IL-6、TGF-β和IL-23(P<0.05),但促进水平低于LPS;EPS可以明显促进BMDCs刺激异基因淋巴细胞的增殖。综上所述,在体外实验中,干酪乳杆菌EPS能够促进BALB/c小鼠BMDCs的成熟,诱导BMDCs分泌与辅助性T17细胞分化和增殖相关的细胞因子IL-6、TGF-β和IL-23,并且可以增强BMDCs的抗原提呈能力。
 
 
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