近年来，等温核酸扩增技术快速发展，例如环介导等温扩增（LAMP）、滚环等温扩增（RCA）和重组酶聚合酶等温扩增（RPA）等。目前，RPA已经用于多种病原体的检测，其操作方法简便，反应20 min内就可以产生检测水平的扩增产物，但仅适合实验室内使用。而免疫层析试纸条（LF）分析只需5 min即可完成目标物的分析，且无需任何特殊设备，通过肉眼就可以观察结果，是一种高效的核酸扩增产物检测方法。
省部共建食品营养与发全国家重点实验室、天津科技大学食品科学与工程学院的陈纯阳、张宸宁、杜欣军*和王硕*等人将RPA技术和LF技术相结合，建立了一种阪崎克罗诺杆菌快速检测方法（RPA-LF）。等温扩增与产物检测步骤可以在20 min内完成，且具有较高的灵敏度和特异性，可用于阪崎克罗诺杆菌的快速检测。本研究旨在为食源性致病菌的快速检测提供技术支持。
1 RPA条件优化
1.1 反应温度优化
在不同温度条件下应用RPA、以试纸条进行检测，结果表明RPA在30～45 ℃均可以扩增阪崎克罗诺杆菌，且检测线颜色深浅与温度有关，由于酶处于最佳反应温度时，扩增效率最高，试纸条检测线部位颜色最深，因此选取45 ℃为后续实验最佳反应温度。
1.2 反应时间优化
在45 ℃进行不同时间的扩增，结果显示扩增5 min后即可出现检测线，并且随着反应时间的延长，检测线颜色加深。但随着扩增时间的延长，引物二聚体产生的非特异性扩增的几率增加，为保证实验准确性、稳定性和快速性，选取15 min作为最佳扩增时间。
2 胶体金试纸条优化
2.1 样品展开液的优化
展开液由于成分不同，所含离子不同，会影响金标抗体的流动性和显色情况，实验中使用PBS（pH 8.5）、PBST（pH 7.4）、PBST（pH 8.5）和蒸馏水4 种溶液进行比较。结果显示PBS和蒸馏水的检测线颜色显示效果较好，pH值为7.4和8.5的PBST检测线较浅，而在上样过程中蒸馏水流动速度较慢，显色时间较长，因此选择PBS（pH 8.5）作为最佳样品展开液。
2.2 NC膜优化
NC膜是决定结果的重要因素之一，Milipore HF 90 s、135 s和180 s三种NC膜检测结果表明：Milipore HF 90 s孔径最大，层析速度快，但是检测线条带颜色较浅；Milipore HF 180 s层析速度慢，检测时间过长；Milipore HF 135 s孔径适宜，层析速度较快，出现条带颜色清晰，因此最终选择Milipore HF 135 s NC膜。
3 灵敏度与特异性分析
3.1 灵敏度分析
为确定RPA-LF检测阪崎克罗诺杆菌纯菌液的检测限，将纯菌液10 倍梯度稀释，水煮法提取DNA作为RPA反应模板，同时进行RPA-AGE与RPA-LF灵敏度进行比较。RPA-LF结果显示随着阪崎克罗诺杆菌的浓度增加时，检测线亮度逐渐增加，当浓度为1.7×102 CFU/mL时，检测线亮度与阴性对照仍然有明显不同。因此，1.7×102 CFU/mL为RPA-LF检测阪崎克罗诺杆菌纯菌液的检测限。RPA-AGE结果显示其检测限为1.7×105 CFU/mL（图6），检测限明显高于RPA-LF。RPA-LF较实时定量RPA在相同的时间内，方法检测限更低，更适合阪崎克罗诺杆菌的快速检测。
3.2 特异性分析
选取15 株阪崎克罗诺杆菌和6 株非克罗诺杆菌，验证RPA-LF方法的特异性。结果显示全部的阪崎克罗诺杆菌均呈阳性，而其他菌种均只有出现质控线，未出现检测线，证明本实验建立的RPA-LF对于阪崎克罗诺杆菌的具有良好的特异性。
4 模拟（增菌）样品检测结果
为验证RPA-LF的实用性，选择婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方羊奶粉、婴幼儿米粉和牛肉为待测样品，添加不同浓度的阪崎克罗诺杆菌，并在37 ℃增菌不同时间。提取样品DNA后，使用RPA-LF检测。
结果表明奶粉和羊奶粉中含有1.7×102 CFU/g的阪崎克罗诺杆菌时，不增菌即可以检出（图8a、d）；当奶粉和羊奶粉中含有1.7×101 CFU/g的阪崎克罗诺杆菌时，37 ℃增菌2 h可以检出（图8b、e）；奶粉和羊奶粉中含有1.7×100 CFU/g的阪崎克罗诺杆菌时，37 ℃增菌4 h可被检出（图8c、f）。
当实际样品为婴幼儿米粉时，结果显示米粉中含有1.7×102 CFU/g阪崎克罗诺杆菌纯菌液时，37 ℃培养1 h可以检出（图8g）；米粉中含有1.7×101 CFU/g的阪崎克罗诺杆菌时，37 ℃培养2 h可检出（图8h）；当米粉中含有1.7×100 CFU/g的目标菌时，37 ℃培养4 h可检出（图8i）。
当牛肉中含有1.7×102 CFU/g的阪崎克罗诺杆菌时，37 ℃培养2 h可以检出（图8j）；当方牛肉中含有1.7×101 CFU/g的阪崎克罗诺杆菌菌液时，37 ℃培养4 h可以检出（图8k）；牛肉中含有1.7×100 CFU/g的菌液后，37 ℃培养6 h可被检出（图8l）。
此结果表明RPA-LF在婴幼儿配方奶粉和米粉中检测1.7×100 CFU/g的阪崎克罗诺杆菌，包括增菌、提取DNA和检测，最多需要5 h可以得出结果；检测牛肉等肉制品所需时间稍长，需7 h得出结果。所有样品同时利用GB/T 4789.40—2016方法进行阪崎克罗诺杆菌检测，结果均为阳性，但是检测所需时长为5 d。将RPA-LF与传统检测方法进行比较可知，二者可获得相同的检测结果，但RPA-LF检测时间远小于传统检测方法。
5 实际样品检测结果
利用婴幼儿配方奶粉、全脂奶粉等20 种实际样品作为检测对象，同时利用RPA-LF检测和国标法检测。结果显示：1 种全脂奶粉和1 种婴幼儿配方奶粉检测结果为阳性，其余样品均为阴性。两种检测方法结果一致，表明RPA-LF具有较高的检测准确性。
结 论
本研究将RPA与LF相结合用于阪崎克罗诺杆菌检测。在纯培养的条件下，RPA-LF检测阪崎克罗诺杆菌纯菌液的检测限为1.7×102 CFU/mL，比传统检测方法、PCR和实时定量RPA检测方法更为快速灵敏。当实际样品污染量为1.7×100 CFU/g阪崎克罗诺杆菌时，此方法可以在5 h内对婴幼儿配方奶粉和米粉、在7 h内对牛肉完成检测。利用20 种实际样品评价RPA-LF的准确性，结果显示RPA-LF与国家标准方法获得一致的检测结果。因此，本研究所建立的RPA-LF是一种简便、快速、适合现场使用的阪崎克罗诺杆菌检测方法。
