花色苷主要位于植物细胞的液泡中，在加工过程中植物组织遭到破坏，细胞壁和液泡成分相互接触，会发生分子间相互作用。进而影响花色苷的提取率，生物利用度，颜色特性和化学稳定性。结合亲和力越大，对花色苷在胃释放或外部降解条件下的保护作用越大。因此，果胶与花色苷的相互作用可能会减缓花色苷在人体内的降解，提高其在结肠环境的代谢能力。现阶段关于果胶和花色苷结合物的研究主要集中在探讨结合物的稳定性及结构变化，但还缺少各类因素对结合效果及其结合状况的研究。
为了探索花色苷与果胶相互结合作用及其作用特点，沈阳农业大学食品学院的魏婧琦、李冬男*和孟宪军*采用超滤离心法测定花色苷与果胶的结合率，超滤离心法是现阶段浓缩、分离样品溶液的常用手段，通过离心作用力使超滤离心管中待分离样品快速通过管壁的中空纤维膜，从而使不同分子质量的物质得到分离。本实验中果胶属于大分子物质，通过对结合物的超滤离心，即可得出花色苷与果胶的结合率。高效液相色谱（HPLC）法分析黑果腺肋花楸中不同花色苷与果胶的结合情况，并对结合后产物的稳定性和抗氧化活性进行测定分析，为进一步探究花色苷与果胶相互作用提供理论依据，为保护相关产品中的花色苷成分提供技术支持。
一、单因素试验结果
1.1 pH值对结合率的影响
结果显示，pH值对果胶与花色苷的结合具有显着影响。随着pH值的升高，黑果腺肋花楸花色苷与果胶的结合率呈现先升高后降低的趋势。当结合pH值为3时结合率最高为80.52%（P＜0.05）。这种现象的产生可能是由于酸性环境中，部分果胶发生去质子化，形成-COO-，而花色苷分子大多以花色苷阳离子形式存在，果胶游离的羧基与带正电的花色苷阳离子发生离子交联，而溶液中的H＋与花色苷阳离子存在竞争关系，使得结合率在pH 3.0时到达结合峰值。
1.2 花色苷与果胶添加比例对结合率的影响
实验过程中始终保持花色苷质量浓度（4 mg/mL） 不变，增加果胶添加量，结果显示，果胶出现从饱和状态至非饱和状态的转变，花色苷与果胶添加比例为1∶2.5时结合率达到87.96%（P＜0.05）的峰值水平。由于花色苷与果胶添加比例为1∶2与1∶2.5时结合率差异变化不大，为降低成本，节约果胶用量，选择花色苷与果胶添加比例为1∶2进行实验。
1.3 金属离子浓度对结合率的影响
结果显示，随着金属离子浓度的增加，Ca2＋、Mg2＋ 结合率曲线均呈现逐步降低的趋势，但Mg2＋结合率曲线降低趋势较小（P＞0.05）。Ca2＋与结合率呈负相关。 Ca2＋、Mg2＋同时存在于酸性条件下，金属离子与羧基之间存在一定的相互作用，果胶离解的游离羧基与阳离子的交联顺序为Ca2＋＞H＋＞Mg2＋，所以Ca2＋的存在阻碍了花色苷与果胶的结合。
1.4 糖类添加量对结合率的影响
糖类会对高甲氧基果胶体系的凝胶强度产生影响，所以分别选取果糖、葡萄糖、蔗糖研究糖类对于结合率的影响。结果显示，随着糖添加量的增加，结合率无显着差异（P＞0.05）。表明糖类添加对于花色苷与果胶的结合率无显着影响。
二、正交试验结果
结果显示，极差值RA为11.64，RB为4.33，说明pH值（A）对于结合率的影响要高于花色苷与果胶添加比例，最佳的结合条件组合为A2B2，即在pH 3、花色苷与果胶添加比例为1∶2.0时进行结合率最高（78.77%）。由方差分析可知，FA=128.020 1＞F0.05（2,2），FB=20.663 0＞F0.1（2,2），说明两因素均对结合率存在影响，并且pH值对于结合率的影响更显着。经验证最优条件为pH 3、花色苷与果胶添加比例为1∶2.0。
三、HPLC分析黑果腺肋花楸花色苷与果胶的结合情况
如图5所示，共出现4 个主体峰，依次为矢车菊-3-半乳糖苷（55.3%）、矢车菊-3-葡萄糖苷（6.1%）、矢车菊-3-阿拉伯糖苷（31.4%）、矢车菊-3-木糖苷（7.0%），这4 种花色苷占整体花色苷的99%以上。
在正交试验所得的最佳结合条件（pH 3、花色苷质量浓度4 mg/mL、果胶质量浓度8 mg/mL）下制备结合物进行结合情况的HPLC分析检测，根据峰面积的减少量计算结合率，以此衡量结合能力。由图6可知，由于花色苷结构上的差异，造成了各类花色苷与果胶结合效果的不同。由于1号峰（矢车菊-3-半乳糖苷）在黑果腺肋花楸花色苷中占有较大比重，总花色苷结合率与1号峰结合率差异不显着（P＞0.05）。前3 个峰（矢车菊-3-半乳糖苷、矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-阿拉伯糖苷）的结合率分别为58.05%、57.66%和58.41%，差异不 显着（P＞0.05），全部高于4号峰（矢车菊-3-木糖苷）的结合率（51.34%）。
四、黑果腺肋花楸花色苷与果胶结合产物的稳定性
4.1 热处理对黑果腺肋花楸花色苷与果胶结合产物稳定性的影响
将花色苷与果胶在pH 3、果胶质量浓度8 mg/mL的条件下制备结合物，进行热稳定性实验。随着处理温度升高、处理时间延长，各样品溶液颜色均发生了明显变化。在70 ℃条件下，随着温度的升高，实验组和对照组溶液颜色逐渐由深紫红色向浅紫色转变。在90 ℃条件下，颜色转变迅速加快，从深紫红色褪至橘黄色。
结果显示，随着温度和处理时间的延长，各样品溶液中的花色苷保留率都呈下降趋势，并且90 ℃条件下花色苷降解速度明显高于70 ℃，实验组的花色苷保留率均高于对照组。说明果胶对花色苷分子在高温条件下的快速降解具有抑制作用。
4.2 体外模拟消化对黑果腺肋花楸花色苷与果胶结合产物稳定性的影响
将花色苷与果胶在pH 3、果胶质量浓度8 mg/mL的条件下制备结合物，进行体外模拟消化实验。在pH值为2的条件下，花色苷分子以红色黄烊盐阳离子形式稳定存在，随着pH值的升高，花色苷分子会从红色黄烊盐离子形式转化为无色的甲醇假碱式，接着经过查尔酮式后分解成褐色物质。所以花色苷在经过胃肠道消化的过程中，胃消化阶段几乎不会对花色苷造成影响。经过胃消化过后，环境pH值骤升至7.5，花色苷含量也骤减，并在2 h的肠消化阶段内，从深紫红色、浅紫色褪至黄褐色。
结果显示，添加了果胶的黑果腺肋花楸花色苷溶液（实验组）的保留率高于不添加果胶的果腺肋花楸花色苷溶液（对照组），与热稳定性实验规律一致，但其对花色苷的影响程度没有温度对花色苷的影响程度大。可能是由于pH值对花色苷稳定性的影响较大。
五、黑果腺肋花楸花色苷与果胶结合产物的抗氧化活性
5.1 羟自由基清除能力比较分析
分别测定相同质量浓度（4 mg/mL）下花色苷溶液、花色苷果胶结合溶液的羟自由基清除能力，结果显示，以VC作为阳性对照，得出VC羟自由基清除标准曲线为y=0.263 5x＋0.061 8，R2=0.949 9，x为VC标准品质量浓度/（mg/mL），y为羟自由基清除率。花色苷溶液与结合物的羟自由基清除率分别为55.24%和45.1%，相当于1.86 mg和1.48 mg VC当量，且两者差异显着（P＜0.05）。说明果胶与花色苷的结合使花色苷的羟自由基清除能力减弱，但结合物仍然具备1.48 mg VC当量的羟自由基清除能力。
5.2 ABTS阳离子自由基清除能力比较分析
分别测定相同质量浓度（4 mg/mL）下花色苷溶液、花色苷果胶结合溶液ABTS阳离子自由基清除能力，结果显示，以VC作为阳性对照，得出VC清除ABTS阳离子自由基标准曲线为y=15.85x－0.276 6，R2=0.99，x为VC质量浓度/（mg/mL），y为Trolox标准品 浓度/（mmol/L）。花色苷溶液与结合物的ABTS阳离子自由基清除效果相当于2.50 mmol/L和1.33 mmol/L的Trolox当量，相当于0.17 mg和0.1 mg的VC当量，且两者差距显着（P＜0.05）。说明花色苷与果胶结合后对ABTS阳离子自由基清除能力产生了一定的负面影响，但结合物仍然具有0.1 mg VC当量的ABTS阳离子自由基清除能力。
5.3 FRAP比较分析
分别测定相同质量浓度（4 mg/mL）下花色苷溶液、花色苷果胶结合溶液的FRAP，结果显示，以VC作为阳性对照，得出VC的FRAP标准曲线为y=7.421x－0.130 1，R2=0.989，x为VC质量浓度/（mg/mL），y为Fe2＋标准品浓度/（mmol/L）。花色苷溶液与结合物分别能还原1.50 mol/L和0.28 mol/L Fe2＋， 相当于0.22 mg和0.06 mg VC当量，且两者差异显 着（P＜0.05）。说明果胶与花色苷的结合对花色苷的FRAP产生了负面影响，但结合物仍然具有0.06 mg VC当量的Fe3＋还原能力。
结 论
本研究通过单因素试验比较pH值、花色苷与果胶添加比例、金属离子浓度和糖添加量对结合率的影响，结果表明，pH值和花色苷与果胶添加比例对黑果腺肋花楸花色苷与果胶的结合效果影响显着；在pH值为3，花色苷与果胶添加比例为1∶2的条件下，结合率可达78.77%；Mg2＋和糖类物质对结合效果影响不显着，Ca2＋的添加则会抑制结合作用。
结果表明，不同类型的花色苷与果胶具有不同的结合效果，结合效果不仅与花色苷分子上羟基和甲氧基的数量有关，还可能受到花色苷分子糖基构型的影响。果胶可以提高花色苷在体内以特殊结构存在的时间，防止花色苷分子在高温处理和碱性条件下的快速降解。同等质量浓度下的花色苷溶液与果胶结合后的花色苷抗氧化能力有一定程度上的减弱，但仍具备较强的抗氧化能力。研究结果为黑果腺肋花楸花色苷与果胶作用机理研究提供理论基础，对于黑果腺肋花楸相关产品的开发具有指导意义。
