目前对茯砖茶中微生物的相关研究主要集中于优势菌种的分离与鉴定、优势菌种代谢物的生理活性研究及生产中某阶段微生物菌群结构的研究等，但是对生产全过程中微生物菌群结构变化的研究较少。近年来，基于分子生物学技术的不断发展，对茯砖茶中微生物多样性的探索已逐渐深入化、全面化。随着高通量技术的发展和运用，越来越多的研究者也将其运用于茯砖茶微生物群落结构的研究，相较于PCR-DGGE法所得的结果，Illumina MiSeq测序所得结果能更准确反映出菌群结构及动态变化。
茯砖茶按照现有工艺分为两类，即机压茯砖茶和手筑茯砖茶两类，前者采用机械自动成型，后者茶叶经汽蒸软化后人工成型，两者由于成型工艺不同有所差异。湖南农业大学食品科学技术学院的陈梦娟、蒋立文*和徐元昊等人采用Illumina MiSeq技术对“控温发酵及升温干燥一条龙”的手筑茯砖茶中真菌菌群结构变化进行研究，以期为合理调控加工进程、揭示微生物的作用机理及构建产品安全保障体系的研究提供一定的参考依据。
测序数据优化及统计
为提高后续分析质量和可靠性，对原始下机数据进行双端拼接、质量控制、嵌合体过滤后，统计有效数据，结果显示，本次测序质量值较高，6 组样品中有效Tags数均在35 000 条以上，并且数据质量≥Q20和≥Q30的数据比例高，所有样品的测序数据都已达到后续分析的要求。
OTU统计及分类学分析
按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列，并绘制出Venn图（图1）。根据对有效数据进行聚类总共得到186 个OTU，图1a 4 组样品中OTU数目分别为172、115、96和48，而共有OTU仅38 个。图1b 3 组样品的OTU数量相近，且共有的OTU数为30 个。根据统计这两个阶段样品中OTU数目可以发现，放入控温室后物种的数量总体呈现出下降的趋势。
样品的α多样性分析
稀释曲线用于反映测序数据量的合理性及样品中物种的丰富程度，由图2可以看出，曲线已趋向平坦，说明测序数据量已接近饱和。发酵及干燥过程中真菌群落多样性指数的结果显示，发酵0 d组（Fj_0 d）的Chao 1指数和Shannon指数最高，表明在毛茶渥堆过程中实际上是一个重要前发酵过程，孕育中微生物孢子萌发，对不耐热营养细胞、细菌类微生物有杀灭效果，使得真菌多样性及丰富度高。但随着发酵的进行各项指数都在逐步下降，在发酵成熟时（12 d）真菌群落多样性降至最低。
发酵及干燥过程中组间真菌群落结构差异性分析
以发酵及干燥阶段样品中的OTU进行作图得到主坐标分析图，通过分析多组样本中OTU组成结构，反映样本间的距离和差异性。如图3所示，主要贡献度之和为99.85%，表明已经可以较好地反映出样本间的种群结构差异，同时根据表3可知，在Weighted Unifrac距离算法下，R值为0.48，且P值为0.00，表明各组的组间差异还是大于组内差异的。图3中发酵阶段4、8、12 d以及干燥阶段17、22 d聚离较近，但与0 d距离较远，表明4、8、12 d及17、22 d样品中真菌菌群结构较为相似，而0 d样品中的群落结构及丰度与其他样品的差异大。同时0 d组内样品间的距离也较远，说明发酵起始，经汽蒸软化、渥堆及手筑成型的茶砖内真菌菌群结构差异较大。
物种注释及分类统计
根据测序结果及物种注释结果，在门和属两个水平上对物种组成进行统计分析并构建对应的丰度谱。本实验共注释到5 个门、14 个纲、29 个目、47 个科、65 个属，选取丰度最高的20 个物种分类进行真菌菌群结构及丰度变化分析。
结果显示，在门分类水平上，发酵及干燥过程中共注释到3 个门的真核微生物，1 个未知分类地位的Fungi unclassified及1 个无法确认分类学信息的unidentified。3 个门类分别是子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和接合菌门（Zygomycota）。其中子囊菌门在这6 组样品中占绝对优势，在Fj_0 d、Fj_4 d、Fj_8 d、Fj_12 d、Gz_17 d及Gz_22 d中的丰度依次是89.12%、99.32%、99.74%、99.98%、99.88%和99.89%。其次是担子菌门及接合菌门，但这两个门类在6 组样品中的相对丰度较低。
结果显示，在属分类水平上，明确注释到分类地位的有1 5 个属，还有1 个无法确认分类学信息的unidentified及4 个未知分类地位（Ascomycota unclassified、Saccharomycetales unclassified、Hypocreales incertae sedis unclassified、Pleosporales unclassified）。在0 d时，真菌的多样性最高，其中相对丰度最高的是曲霉属（Aspergillus），达40.59%。其次是德巴利酵母属（Debaryomyces）、散囊菌属（Eurotium）和青霉属（Penicillium），相对丰度分别为17.26%、9.02%、8.55%。在4 d时，手筑茯砖茶样中散囊菌属的相对丰度上升至97.27%，而其他属相对丰度的总和已降至3%以下，并且在手筑茯砖茶发酵的中后期（8、12 d）及干燥阶段（17、22 d）的样品中，相对丰度最高的菌属均为散囊菌属，分别为97.94%、99.85%、99.51%及99.50%。
本实验选择丰度排行前20的物种进行制图，对6 组样本中的基因进行聚类分析。由图6可看出明显的优势菌群更替过程，除散囊菌属（Eurotium）外，曲霉属（Aspergillus）、德巴利酵母属（Debaryomyces）、青霉属（Penicillium）、酵母菌属（Sacharomyces）、红酵母属（Rhodotorula）、隐球酵母属（Cryptococcus）等菌属的相对丰度均随发酵及干燥的进行呈现出明显下降趋势。这表明了在手筑茯砖茶制作初期的汽蒸软化过程后，原料经过两次高温瞬时处理后湿热渥堆一段时间，样品微生物已经交替发生变化。但随着恒温发酵的进行，优势菌群发生了明显的交替变化。而干燥阶段由于温度逐步升高茶砖中水分缓慢蒸发，因此仅有部分耐高温、好干性的真菌得以生存。
讨 论
本实验采用高通量测序技术对手筑茯砖茶生产过程中真菌多样性及分类学概况进行了研究，在6 组样品中共得到990 522 个有效Tags，并注释到5 个门、14 个纲、29 个目、47 个科、65 个属。本实验样品经汽蒸软化、手工压制及完成包装后放入控温室中进行发酵并干燥制成的成品，从属分类水平上可看出，发酵4 d时，散囊菌属的相对丰度已经达到较高的水平，并且在发酵后期及干燥阶段中散囊菌属都是绝对优势菌种。本实验结果表明，采用控温室发酵可能对手筑茯砖茶发花过程中散囊菌属的生长起促进作用，同时，由于茶砖已用牛皮纸包装，所以不易受到外界环境污染，更有利于手筑茯砖茶的后期保存。
研究也发现，在手筑茯砖生产过程中，发酵过程中微生物主要来源于毛茶及茶梗本身带入，也可能是生产环境中带入，在恒温控湿发酵过程中，散囊菌属一开始就占据比较高的比例，尽管其他微生物也存在，但包装后创造相对密封条件微生物之间相互拮抗、相互协调创造了必要环境，微生物群属也会发生相应变化，而缓慢升温干燥水分减少为微生物“适者生存”提供了外部条件，这些相互影响因素值得以后研究中进一步探索。
由于目前对冠突散囊菌具体特征属性物质的研究还不多，它是否属于散囊菌属也还存在一些争议，而实验结果中高表达丰度的散囊菌属，其具体的种以及涉及的功能，还有待进一步研究分析。因此后续实验将利用蛋白组学、代谢组学等技术对手筑茯砖茶中微生物间的相互作用、特征性物质种类的鉴定及特殊风味物质形成的机理进行进一步深入分析。
