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乳酸菌抑制N-亚硝胺形成的机理探究及应用效果

放大字体  缩小字体 发布日期:2020-03-24
核心提示:N-亚硝胺具有致癌、致畸、致突变性,对人体健康有极大危害。如何降低产品中N-亚硝胺的含量对于食品安全控制方面具有重要的意义。乳酸菌在传统发酵食品中应用广泛,有提高产品风味和营养的作用。
   N-亚硝胺具有致癌、致畸、致突变性,对人体健康有极大危害。如何降低产品中N-亚硝胺的含量对于食品安全控制方面具有重要的意义。乳酸菌在传统发酵食品中应用广泛,有提高产品风味和营养的作用。目前学者利用乳酸菌抑制N-亚硝胺多针对发酵食品,但研究多为在发酵温度(如37 ℃)下探究乳酸菌对N-亚硝胺的降解机理,对于无发酵工艺的产品加工中则不太适用,如红肠等。
 
  天津农学院食品科学与生物工程学院的李秀明、刘静静和马俪珍*等人将PRO-MIX5分别于肉糜培养基和MRS培养基中扩增培养,在亚硝酸盐的降解体系和N-二甲基亚硝胺形成体系中,分别对乳酸菌代谢产物、菌体、胞内酶以及菌体碎片进行筛选,研究PRO-MIX5乳酸菌发酵剂抑制N-亚硝胺形成的机理,同时提取其中可抑制N-亚硝胺形成的物质,应用于红肠和培根中,验证其在产品中对N-亚硝胺的抑制效果。本研究对生产安全、高品质食品具有重要的意义。
 
  1. 在肉糜培养基中培养PRO-MIX5
 
  1.1 发酵代谢产物对亚硝酸盐的降解作用
 
  发酵上清液和混合发酵液添加量对模拟体系中亚硝酸盐的降解作用结果显示,随着作用时间的延长和添加浓度的增加,发酵上清液和混合发酵液均不能显着降解体系中的亚硝酸盐含量。
 
  温度对模拟体系中亚硝酸盐的降解作用结果显示,在4 ℃和35 ℃条件下添加发酵上清液的模拟体系中亚硝酸盐含量随着反应时间的延长均未显着降低,可知随着发酵上清液添加量的增加、反应温度的提高和反应时间的延长,菌体发酵的代谢产物依然没有显着降解亚硝酸盐的效果,综上结果说明在发酵时能够起到降解亚硝酸盐的物质并不存在于乳酸菌的发酵代谢产物中。
 
  1.2 乳酸菌胞内酶释放后对亚硝酸盐的降解作用
 
  按照前述方法步骤对乳酸菌发酵液处理后进行实验,结果如图4所示。实验结果表明,由PRO-MIX5制得的混合发酵液、沉淀与水混合物、沉淀与PBS混合物、乳酸组发酵液随着反应时间的延长,均能对亚硝酸盐起到降解作用(P<0.05),且不同处理方式对亚硝酸盐降解率由大到小顺序依次为:沉淀与水混合物>混合发酵液>乳酸组发酵液>沉淀与PBS混合物,其中混合发酵液和沉淀与水混合物处理方式在保温反应过程中对亚硝酸盐降解率结果显示,将细胞破碎释放出胞内酶后,对亚硝酸盐降解作用显着,但沉淀与水混合物降解效果优于混合发酵液是由于胞内酶释放后不稳定,且可能受到上清液中代谢产物如过氧化氢的作用影响了其活性,而用水取代发酵上清液后破碎菌体则能较好地使胞内酶和菌体碎片发挥作用,在保温2 h时对亚硝酸盐的降解率可达53.49%,相反,用 0.01 mol/L、pH 7.4的PBS并不能更好地维持亚硝酸盐还原酶的稳定性,反而使酶活性大大下降。
 
  1.3 混合发酵液和沉淀与水混合物对NDMA形成的影响
 
  以形成NDMA的模拟体系对微生物抑制剂的制作进一步筛选。结果显示,混合发酵液和沉淀与水混合物均极大地促进了NDMA的形成。混合发酵液对NDMA形成的促进能力显着高于沉淀与水混合物(P<0.05),且其促进能力几乎为沉淀与水混合物的2 倍。由于沉淀与水混合物已离心除去上清液,由此说明该发酵剂的代谢产物中可能存在着能够促进NDMA形成的物质,因而所制备的发酵液沉淀中可能存在能够抑制NDMA形成的物质,且该物质可能存在于菌体中。
 
  2. PRO-MIX5培养
 
  为排除肉糜培养基为N-亚硝胺形成提供胺类物质等前体物,且进一步验证有效物质存在于菌体中,将PRO-MIX5接种至MRS肉汤培养基中进行培养。
 
  2.1 不同处理方式的菌体对NDMA形成的影响
 
  结果显示,4 种作用方式均不同程度地促进NDMA形成,但促进效果远低于1.3节的结果,其中活菌在模拟体系中保温2 h,NDMA形成量明显高于其他3 组,且添加活菌直接亚硝化反应组中NDMA形成量也高于死菌组,说明在活菌保温2 h的过程中以及在80 ℃中反应,活菌可能产生了一些能够促进NDMA形成的物质。而死菌在模拟体系中保温2 h对NDMA促进效果几乎一致,且促进率较低,对比活菌结果,推测菌体中可能含有抑制 N-亚硝胺形成的物质,且该物质不是一种活性蛋白酶,具有一定耐热性。
 
  2.2 菌体不同组分对NDMA形成的影响
 
  结果显示,沉淀组,即添加PRO-MIX5的菌体碎片(包含细胞壁碎片、细胞膜碎片、细胞器、包涵体等物质)对NDMA的形成具有显着的抑制效果,可能是由于菌体碎片对N-亚硝胺具有一定的吸附作用,但其具体机理仍需进一步深入研究;上清液和混合体则促进了NDMA形成,其中混合体组促进效果显着大于上清液,说明沉淀物菌体碎片的存在可能会增加上清液对NDMA形成的促进作用,其具体相互作用的机理亟待研究。
 
  2.3 对乳酸菌培养方式、菌体碎片添加量的筛选
 
  结果显示,使用添加0.04 μg/mL NAS的MRS培养基扩增培养PRO-MIX5,得到的菌体碎片对NDMA形成的抑制效果最佳,随着添加量的变化,对NDMA的抑制效果较为稳定,且在筛选的几个添加量范围内添加量越低,NDMA的形成量越低,可使用添加量范围较广,以此作为为本实验筛选出的抑制NDMA形成效果较好的抑制物质,进一步应用于实际产品的加工中。
 
  3. PRO-MIX5菌体碎片在红肠和培根中的应用效果
 
  结果显示,相比CK组,在红肠中添加0.05%和0.5%的菌体碎片能够显着降低产品中NDMA的形成,抑制率分别为53.03%和63.52%,其中以0.05%添加量对9 种N-亚硝胺总形成量的抑制效果最佳,抑制率可达到41.04%、0.25%和0.5%添加量对9 种N-亚硝胺总形成量抑制率分别为16.13%和13.48%。在培根中添加0.05%的菌体碎片抑制N-亚硝胺的效果相对较好,对NDMA形成的抑制率为27.58%,对9 种N-亚硝胺形成总量的抑制率为13.83%,而0.25%和0.5%添加量无显着抑制效果。说明所制得的菌体碎片不仅能够抑制产品中N-亚硝胺的形成,且在较低添加量下就能起到抑制作用,应用效果良好。
 
  结    论
 
  PRO-MIX5的菌体碎片具有抑制N-亚硝胺形成的效果,且使用添加0.04 μg/mL NAS的MRS肉汤培养基培养PRO-MIX5,经过4 ℃、5 000h g离心15 min得到菌体,用25 mmol/L,pH 6的PBS冲洗菌体2 次,再以该PBS以1∶4的比例稀释,添加终质量浓度为1 mg/mL的溶菌酶作用后,超声波破碎5 min,经4 ℃、10 000h g离心10 min得到的沉淀(菌体碎片)为能够有效抑制N-亚硝胺形成的物质;以添加量均为0.05%应用于红肠和培根的加工中,对9 种N-亚硝胺形成的总量抑制效果相对较好,阻断率分别为41.04%和13.83%,研究结果对肉制品安全控制方面具有重要意义。
 
 
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