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qPCR关键参数—Ct值

放大字体  缩小字体 发布日期:2020-03-25
核心提示:在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数
   Ct 值的定义
 
  在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,如图所示。
 
  Ct值与起始模板的关系
 
  研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值,如图所示。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
 
  Ct值的重现性
 
  PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
 
  Ct值与起始模板的线性关系
 
  由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
 
  Ct值检测出现的问题
 
  无Ct值出现
 
  检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集,Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
 
  引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。
 
  模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
 
  模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
 
  Ct值出现过晚(Ct>38)
 
  扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
 
  PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
 
  PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。
 
 
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