目前，对不同和相同水系产地之间中华绒螯蟹的差异，在形态、DNA、脂肪酸以及电子舌、 电子鼻等方面均已经有了一些探索研究。本实验室在以前的研究中利用形态学和多种矿质元素两种方法主要对来自长江水系的中华绒螯蟹进行产地判别研究，但对黄河、辽河水系的中华绒螯蟹还缺乏研究。同时，为提高产地鉴别效果，稳定同位素分析技术也需要应用于中华绒螯蟹的产地溯源研究中。此外，矿质元素含量和稳定同位素比率“指纹”的结合分析甚至可提高海鳟、虾等水产品的产地判别准确率
因此，南京农业大学无锡渔业学院的骆仁军、杨健*和中国水产科学研究院长江中下游渔业生态环境评价与资源养护重点实验室、淡水渔业研究中心的姜涛等人尝试用单因素方差分析及Duncan多重比较检验分析稳定同位素比和矿质元素含量的产地间差异，然后利用SOM方法将12维特征因子投射到合适的二维空间中并进行分类，同时对矿质元素和稳定同位素等产地特征因子等参数进行可视化分析，最后对中华绒螯蟹进行逐步判别分析，并筛选出用于建立判别模型的矿质元素和稳定同位素，以期进一步完善中华绒螯蟹的产地判溯源模型。
1、稳定同位素和矿质元素产地差异分析
本研究对3 个产地中华绒螯蟹第3步足样本利用IRMS进行了碳、氮稳定同位素比的测定，在所有螃蟹样品中δ15N结果范围是1.7‰～14.6‰，δ13C范围是－22.9‰～－14.0‰。结果显示，在单因素方差分析中，δ13C和δ15N均差异极显着（P＜0.001）。从研究结果可以看出东营样本同时具有最低的δ13C和δ15N，盘锦的螃蟹δ15N值较高，营口的螃蟹δ13C值最高。通过单因素方差分析，在3 个产地间，δ13C和δ15N均差异极显着（P＜0.001），Duncan多重比较显示δ13C在不同水系的产地间差异显着（P＜0.05），来自同一水系的盘锦和营口螃蟹的δ13C差异不显着（P＞0.05），但显着高于东营（P＜0.05），而δ15N在3 个产地间均差异显着（P＜0.05)，且盘锦＞营口＞东营。
同时，研究中还利用ICPMS分析了Na、Mg、Al、K、Ca、Mn、Cu、Zn、Sr、Ba 10 种矿质元素的含量。由于选取完整的第3步足作为样本，螃蟹的外骨骼占比较大，Ca元素含量最高。通过单因素方差分析，在3 产地间Na、Al、Zn、Sr、Ba均差异极显着（P＜0.01），K、Mg差异显着（P＜0.05），Ca、Mn、Cu差异不显着（P＞0.05）。Duncan多重比较显示，东营Na元素显着低于盘锦和营口（P＜0.05），盘锦和营口之间差异不显着（P＞0.05）。Zn、Sr、Ba元素产地间的差异明显，其中东营的Zn是盘锦和营口的1.5～2 倍，Sr是盘锦和营口的2 倍，Ba元素含量也达到了盘锦和营口的3 倍左右，而Zn、Sr、Ba在营口和盘锦间差异不明显，但是Mg、Al、Mn在盘锦和营口之间差异极显着。
2、自组织神经网络分析
利用2 种稳定同位素和1 0 种矿质元素，并运用自组织神经网络对中华绒螯蟹进行聚类分析（图1）。本研究中网络大小选择按量化误差（QE）和拓扑误差（TE）最小的原则，40（8×5） 个神经元大小（响应3 个产地样本60 个样品）可得到最好的网络训练效果，QE和TE值分别为0.436、0.017。
在SOM分析时，常用聚类算法评价指标（DBI）指数的最小值确定聚类数。稳定同位素SOM分析的最小DBI指数为0.865 6，聚类组为4；矿质元素SOM分析的最小DBI指数为0.841 9，聚类组为2；结合稳定同位素和矿质元素SOM分析的最小DBI指数为0.851 6，聚类组为2 类。通过调整聚类数，SOM分析了从聚类数为4 类到2 类的情况（图1）。仅利用稳定同位素同位素则是将大部分东营样本（图1a、I、IV）和少部分营口和盘锦样本（图1a、I、II）分为一大类，无法将两水系聚为2 类（图1a）。结合稳定同位素比和矿质元素或仅利用元素可以将黄河水系的东营样本单独聚为一类（图1b、c），将辽河水系的盘锦和营口两个产地样品聚为一类。仅矿质元素则是将东营分为3 类（图1b、II、III、IV），再与辽河水系两个产地的样本（图1b、I）进一步聚类；结合稳定同位素比和矿质元素，东营被分为2 类（图1c，I、II），同时有大部分盘锦样本被区分出来（图1c、III）。结合稳定同位素和矿质元素其分类效果优于仅使用矿质元素，仅用同位素效果明显地差于仅用元素或结合稳定同位素和矿质元素。
为了直观地展示12 种成分在3 个不同产地间的分布规律，采用SOM聚类分析对这些产地差异因子进行了分析。通过不同样品12 个参数在神经元上的响应图，可泛化、可视化各聚类组的时空变化，利用这12 种成分的分布将产地分为4 组。而且，可进一步观察不同产地的螃蟹样品参数信息，如图2a所示，图中颜色越接近红色表示相对含量越高，颜色越接近蓝色表示相对含量越低。显然，矿质元素和稳定同位素在4个螃蟹分布组别上可被进一步识别，如Zn、Sr、Ba等元素具有相似特征，在东营分布区域（图2b、I、II）元素含量明显高于盘锦和营口，Na元素则相反。其他元素分布特征各不相同，δ13C第III类中明显高于其他区域，Mg在I和II分界处较高，在IV中则比较低。Al在I、II、III均有重叠。
3、线性判别分析
采用线性判别分析法对δ13C和δ15N建立判别模型，结果显示其判别准确率为66.7%，说明此两个因子能一定程度的区分3 个产地，但是较多的误判样本，交叉验证正确率仅为65.0%，东营和营口以及盘锦和营口均有较多的误判。而本研究矿质元素分析的10 个元素结合线性判别分析，可以得到95.0%的正确率，然而，其交叉验证的总体正确率仅为85.0%，说明线性判别模型的稳定还需进一步提高。在结合稳定同位素和矿质元素之后，线性判别模型的正确率可以达到96.7%，交叉验证的正确也提高到91.7%，模型的初始正确率和交叉验证正确率均得到了提高。
仅利用矿质元素通过逐步判别分析，可以筛选出Na、Al、K、Zn、Sr、Ba 6 种矿质元素用于建立判别函数，得到的函数1的方差贡献率是82.2%，函数2的方差贡献率是17.8%。利用函数1和函数2作散点图。在结合矿质元素与同位素进行线性判别分析中，通过逐步判别分析，筛选出δ13C、δ15N、K、Zn、Ba 5 个因子用于建立判别函数。函数1的方差贡献率是84.3%，函数2的方差贡献率是15.7%。利用函数1和函数2作散点图。结果显示，仅利用矿质元素或结合矿质元素与同位素的产地区分效果均十分明显，仅个别样品交叉，各产地内样本基本被完全区分。
讨 论
本研究中，螃蟹样品δ15N结果范围为1.7‰～14.6‰，δ13C范围为－22.9‰～－14.0‰，Duncan多重比较显示来自同一水系盘锦和营口螃蟹的δ13C差异不显着（P＞0.05），与东营之间差异显着（P＜0.05），而δ15N在3 个产地间均差异显着（P＜0.05），样品间比值的差异可以显示出生活在不同环境中的螃蟹对稳定同位素分馏效应的差异。本研究中，通过单因素方差分析，Na、Al、Zn、Sr、Ba均差异极显着（P＜0.01），K、Mg差异显着（P＜0.05），可应用于产地溯源研究。Zn、Sr、Ba元素产地间的差异明显可以用于区分东营，但是盘锦和营口差异不显着。而Mg、Al、Mn在盘锦和营口之间差异极显着，可以用于区分盘锦和营口。
本研究表明SOM的分类和可视化分析，在中华绒螯蟹的产地溯源中将具有较好的应用潜力。本实验对中华绒螯蟹δ13C和δ15N的结果进行判别分析，显示其判别准确率为66.7%，说明此两个因子能一定程度的区分3 个产地，但是存在较多的误判样本；交叉验证准确率仅为65.0%，说明并不能仅靠这两个因子做中华绒螯蟹的产地溯源，需要分析更多地稳定同位素或者与其他溯源方法结合。元素在中华绒螯蟹的产地溯源中具有较好的效果。
本实验研究结果显示，单独利用元素指纹对3 个产地进行判别分析，其综合判别率达到95%，证明使用第3步足的元素分析能较大程度对黄河以及辽河水系不同养殖环境下中华绒螯蟹进行产地区分。然而，其交叉验证的正确率仅为85%，说明线性判别模型的稳定性还需进一步提高。研究结合稳定同位素和矿质元素之后，线性判别模型的正确率可以达到96.7%，交叉验证的正确也提高到91.7%，模型的正确率和稳定性均得到了提高。同时，线性判别分析可以对产地判别因子进行筛选。本研究仅利用元素通过逐步判别分析，筛选出Na、Al、K、Zn、Sr、Ba 6 种矿质元素用于建立判别函数。同时，通过对两种稳定同位素和10 种矿质元素的逐步判别分析，仅利用δ13C、δ15N、K、Zn、Ba建立的判别函数可以得到交叉验证正确率91.7%的产地判别效果，这些矿质元素或稳定同位素比的单因素方差分析在产地间均差异显着（P＜0.05）或差异极显着（P＜0.01），并且在SOM的可视化分析中，这些元素在不同分类区域中差异明显。
结 论
通过对黄河和辽河3 个产地的中华绒螯蟹进行稳定同位素比和矿质元素分析，结合化学计量学对中华绒螯蟹进行产地鉴别。结果表明：通过单因素方差分析及Duncan多重比较检验，3 个产地间Na、Mg、Al、K、Zn、Sr、Ba 7 个矿质元素以及δ13C和δ15N2 个稳定同位素比在产地间有显着差异，而Ca、Mn、Cu 3 个元素差异不明显。而在SOM神经网络聚类分析中，单独利用元素或结合稳定同位素和矿质元素的最佳聚类效果均可将黄河口东营聚为一类，辽河的盘锦和营口的样本聚为另一类，同时可视化分析展示了稳定同位素比和矿质元素在产地间的差异性分布，研究表明SOM的无监督分类和可视化分析，在中华绒螯蟹的产地鉴别中将具有较好的应用前景。
逐步判别分析分别对稳定同位素、矿质元素以及结合稳定同位素和元素进行分析，仅利用矿质元素通过逐步判别分析，筛选出Na、Al、K、Zn、Sr、Ba 6 种矿质元素用于建立判别函数可以区分3 个产地，正确率达到95%，而结合稳定同位素和矿质元素筛选出δ13C、δ15N、K、Zn、Ba 5 个因子用于建立的判别函数具有更高的产地判别正确率，正确率达到96.7%，因此单利用元素或稳定同位素和矿质元素均可以进行中华绒螯蟹的产地鉴别，且稳定同位素和矿质元素的结合具有更高的产地鉴别潜力。本研究结果对黄河和辽河水系乃至全国的中华绒螯蟹地理标志产品保护和“洗澡蟹”等的鉴别方面将可提供重要的参考依据和理论支撑。
