东北农业大学工程学院的薛宏坤、刘 钗、刘成海*等人采用AB-8大孔树脂-SephadexLH-20葡聚糖凝胶联用技术分离纯化‘巨峰’葡萄皮中花色苷，获得单一高纯度的花色苷组分；利用超高效液相色谱三重四极杆飞行时间质谱联用技术对纯化后所得的花色苷组分进行结构鉴定及探究花色苷组分的抗肿瘤活性。
1、‘巨峰’葡萄皮花色苷得率
依据式（1）计算可得，色素I、色素III和色素IV的得率分别为（0.108±0.011）%、（0.053±0.007）%和（0.038±0.005）%，而根据‘巨峰’葡萄皮花色苷的含量计算可得花色苷的理论得率范围为0.21%～0.25%。因此，该纯化分离方法在制备效率上是可行的。
2、紫外-可见光谱分析结果
样品1再经Sephadex LH-20凝胶分离纯化后，‘巨峰’葡萄皮色素溶液被凝胶柱分离成4 个不同颜色的色素带，分别为色素I（淡粉色）、色素II（橙色）、色素III（紫红色）和色素IV（粉红色），对各色素带在200～700 nm范围内进行紫外-可见光谱扫描。色素II在280 nm和520 nm附近均无紫外吸收峰，结果表明色素II为非花色苷类的物质，不再进行后续的研究。而色素I、色素III和色素IV均在280 nm和520 nm附近有最大吸收峰，由此可知，色素I、色素III和色素IV均为花色苷类物质，另外色素III在305 nm波长处有弱的吸收峰，由此说明色素III可能为酰基化的花色苷类物质。
3、HPLC分析结果
在520 nm条件下，样品1共检测出6 种花色苷组分，出峰时间集中在13～22 min范围内。出峰时间在13.69 min和21.84 min为样品1中主要的2 种花色苷组分，两种组分相对含量分别为38.15%和47.62%。其他4 种组分的出峰时间依次为15.51、16.99、19.05、20.04 min，其相对含量分别为2.57%、4.08%、4.05%、3.53%。样品2共检测出4 种花色苷组分，出峰时间在13.63 min和21.86 min仍为主要的2 种花色苷组分，其相对含量分别为27.58%和69.11%，其他两峰的出峰时间分别为17.06 min和19.09 min，相对含量分别为2.08%和1.23%。对比样品1和样品2中花色苷组分比例发现，样品经不同纯化方法所得的花色苷比例差别较大。
4、超高效液相色谱三重四极杆飞行时间质谱联用分析结果
结果可知，色素I保留时间为2.57 min，MS和MS2信息表明，其分子离子峰[M＋]为595.4，在质谱中检测到两个碎片离子分别为m/z 449.1和m/z 287.2。m/z 287是矢车菊色素的特征离子，碎片（[M－146]＋）对应于花色苷分子中失去一个鼠李糖基所得的碎片，而m/z 287的碎片（[M－146－162]＋）对应于m/z 449的碎片上再失去一个己糖基得到的碎片。
色素III保留时间为4.87 min，MS和MS2信息表明，其分子离子峰[M＋]为801，碎片离子m/z分别为331.1、493.2和639.1。m/z 331是锦葵色素的特征离子，m/z 493对应锦葵色素的单己糖，m/z 639对应锦葵素-香豆酰单己糖，碎片（[M－146]＋）对应于香豆酸脱去一分子水后所得的碎片。A440 nm/Aλmax的百分比为13.2%，推测色素III为3,5-双己糖。
色素IV保留时间为6.35 min，MS和MS2信息表明，其分子离子峰[M＋]为493，碎片离子m/z 331.1。m/z 331是锦葵色素的特征离子，丢失碎片162，可能为葡萄糖和半乳糖，结合文献可知色素IV为锦葵-3-半乳糖苷。
5、花色苷组分对HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞生长增殖抑制作用
3 种花色苷组分处理HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞24 h后，两种癌细胞的存活率随3 种花色苷组分质量浓度增加呈现显着降低的趋势（P＜0.05）。当花色苷组分质量质量浓度在50 mg/mL时，色素I、色素III和色素IV样品对HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞的存活率分别为（90.01±2.03）%、（85.11±1.86）%、（91.02 ± 1.55 ）% 和 （ 90.03 ± 1.43 ）% 、（83.99±1.89）%、（91.98±1.52）%，而当花色苷组分质量浓度在600 μg/mL时，色素I、色素III和色素IV样品对HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞的存活率分别为（51.98±0.87）%、（46.05±0.92）%、（58.05 ± 0.84 ）% 和 （ 47.97 ± 0.89 ）% 、（42.04±0.82）%、（53.12±0.91）%，前者较后者HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞的存活率分别降低了38.03%、39.06%、32.97%和42.06%、41.95%、38.86%。
6、花色苷组分对HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞侵袭能力的影响
分别与HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞对照组相比，3 种花色苷组分处理HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞后，发现穿膜细胞数量明显降低，侵袭率显着降低。依据式（3）（下图所示）可计算出对照组、色素I、色素III和色素IV对HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞侵袭率分别为100%、（55.81±1.69）%、（19.65±1.24）%、（34.16±0.97）%和100%、（48.18±1.62）%、（14.57±0.79）%、（34.12±1.02）%，分析数据发现，3 种花色苷组分均能显着抑制HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞侵袭能力，3 种花色苷组分对HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞侵袭抑制能力大小顺序依次是色素III＞色素I＞色素IV。该研究结果与MTT实验结果一致。
结论
‘巨峰’葡萄皮色素粗提物经 AB-8 大孔树脂纯化-葡聚糖凝胶Sephadex LH-20纯化后，得到4 种组分，其中色素II为非花色苷类，色素I、色素III和色素IV分别为矢车菊-3-芸香糖苷、锦葵素-3,5-双葡萄糖苷-香豆酰和锦葵-3-半乳糖苷，其得率和纯度分别为（0.108±0.011）%、（0.053±0.007）%、（0.038±0.005）%和98.52%、96.84%、91.36%；而‘巨峰’葡萄皮色素粗提物经AB-8大孔树脂纯化-聚酰胺树脂纯化后，样品在相同HPLC条件下检测，花色苷组成比例相差较大，原因需进一步研究。探究色素I、色素III和色素IV对抗肿瘤活性的影响发现，3 种花色苷组分均能显着抑制HepG2肝癌细胞和A549肺癌细胞的增殖和侵袭能力，并且显着增加癌细胞的凋亡。3 种花色苷组分的抗肿瘤效果顺序依次为色素III＞色素I＞色素IV。
