大多数非酿酒酵母由于乙醇的耐受性差，很难保证葡萄发酵的顺利进行和完成。于是，非酿酒酵母与酿酒酵母（Sc）的混合发酵成为葡萄酒增香酿造的一种有效方式。截止目前，许多优选非酿酒酵母菌株已被用于混合发酵改善葡萄酒风味，但不同种的非酿酒酵母与Sc混合发酵的葡萄酒在香气成分与感官质量方面也存在较大差异。
西北农林科技大学食品科学与工程学院的李爱华、商洛市蚕果站的王凌云和西北农林科技大学葡萄酒学院的陶永胜*等人的实验研究优选汉逊酵母菌株混合发酵对刺葡萄酒香气质量的调整作用，通过分析优选有孢汉逊酵母（Hu）与Sc混合发酵对刺葡萄酒香气成分的促进效果，旨在揭示混合发酵引起刺葡萄酒典型的品种香气成分和发酵香气成分的变化，确定理想的酵母接种策略，为刺葡萄酒增香酿造提供技术支持。
1. 香气成分的SPME-GC-MS分析
不同发酵处理酒样中共定量分析出47 种香气成分，其中品种香气成分13 种，包括C6化合物、萜烯类、C13-去甲类异戊二烯、硫醇、挥发性酚类、醛酮类6 类；发酵香气成分34 种，包括高级醇、脂肪酸、酯类、苯乙基类化合物4 类。对不同处理样品中10 类香气物质进行PCA，前2 个主成分分别占总体方差的57.0%和30.5%，前2 个主成分上香气类别的载荷及酒样的分布见图1。C6化合物、硫醇、挥发性酚类、醛酮类、高级醇、短链脂肪酸乙酯、其他酯以及苯乙基类化合物主要分布在酒样SF2周围，处于PC1正向端。CK酒样在PC1负向端，周围分布有萜烯类和C13-去甲类异戊二烯。脂肪酸和中链脂肪酸乙酯处于PC2正向端，CF和CK在其左右，而SF1在PC2负向端。综合分析可得，SF2促进了大多数发酵香气成分的生成，除硫醇外，不利于品种香气成分的积累。
2. 品种香气分析
混合发酵酒样中萜烯类、C13-去甲类异戊二烯化合物的含量明显比CK酒样中的低，对于C6化合物，混合发酵却增加了酒样中的该类物质含量，并且随着Sc接种时间的延迟增加幅度越大，相比CK酒样，SF2酒样中的1-己醇含量显着升高。值得注意的是，在刺葡萄干红葡萄酒中检测到了2 种硫醇类物质，3-甲硫基丙酸乙酯和3-甲硫基-1-丙醇，并且与CK酒样相比混合发酵显着提高硫醇类化合物含量，增加量在50%左右。
另一类在混合发酵样品中含量显着增加的是挥发性酚，丁子香酚是供试酒样中检测到的唯一的挥发性酚，在混合发酵酒样中的含量显着高于CK酒样，且含量接近于嗅觉阈值。醛酮类物质在不同酒样之间差异不大。对OAV大于0.1的品种香气成分进行PCA，结果如图2所示。PC1和PC2分别占总体方差的52.0%和35.4%。不同发酵处理之间差异明显，与CK相比，混合发酵增加了β-大马酮、3-甲硫基-1-丙醇、1-己醇、丁子香酚的质量浓度，其中含量较大的里哪醇与β-紫罗兰酮的含量远不及CK酒样中的多，这也是混合发酵引起萜烯类和C13-去甲类异戊二烯化合物含量下降的主要原因。
3. 发酵香气分析
对于发酵香气成分，混合发酵显着增加了刺葡萄酒中高级醇的含量，但其总质量浓度低于250 mg/L。混合发酵酒样中，异丁醇、1-丁醇、异戊醇、1-辛醇、3-甲基-1-戊醇、3-乙氧基-1-丙醇和2,3-丁二醇的含量显着高于CK酒样，其中异戊醇的OAV大于1，1-丁醇和2,3-丁二醇的OAV小于0.1，其余OAV在0.1～1之间。供试酒样中一共检测到15 种酯类物质，概括为乙酸酯、短链脂肪酸乙酯、中链脂肪酸乙酯和其他酯类。
结果显示，顺序接种处理显着提高了刺葡萄酒中乙酸酯的含量，其中乙酸乙酯的质量浓度是CK酒样中的2～4 倍。乙酸酯中乙酸异戊酯含量显着增加，且其OAV大于1，赋予刺葡萄酒香蕉香气特征。供试酒样中检测出3 种短链脂肪酸乙酯，分别为2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯和丁酸乙酯，它们的OAV均大于1，CF和SF2处理显着提高了它们的质量浓度，可增强葡萄酒的果香。而混合发酵显着降低了刺葡萄酒中中链脂肪酸乙酯的质量浓度，尤其是顺序接种处理。
此外，混合发酵显着提高了刺葡萄酒中其他酯的质量浓度，尤其是乳酸乙酯，含量比CK酒样中增加了约50%。相比CK酒样中的脂肪酸含量，顺序接种处理酒样中的含量显着降低，而CF酒样中的含量却明显升高，这与中链脂肪酸乙酯的含量变化一致。对于苯乙基类化合物，混合发酵显着提高了苯乙基类化合物的含量，其中SF2处理中的含量是CK酒样中的1.8 倍。
对OAV大于0.1的发酵香气成分进行PCA，PC1、PC2分别占数据总体方差的45.7%和43.8%，前2 个主成分上发酵香气成分的载荷及供试酒样分布见图3。分析可见，不同接种处理对发酵香气成分含量的影响大不一样，混合发酵明显增加了刺葡萄酒中的发酵香气成分含量，其中顺序接种处理明显有利于乙酸酯类、短链脂肪酸乙酯类和苯乙基类成分的增加，CF处理在乙醇酯和脂肪酸含量上有优势，而CK酒样仅在中链脂肪酸乙酯含量上较高。
4. 累积气味活性分析
将供试葡萄酒中不同化学类别的挥发性成分的OAV累积，并作不同发酵处理之间的数据归一化处理，比较结果如图4所示。混合菌种发酵处理不利于刺葡萄酒中品种香气成分的气味表现，尽管C6化合物、挥发性酚和硫醇的OAV有所提高，但混合发酵并没有让其质量浓度超过嗅觉阈值，反而重要的萜烯类和C13-去甲类异戊二烯类化合物的气味活性明显下降。混合发酵提高了刺葡萄酒中发酵香气成分的气味活性，CF在乙醇酯的气味活性上有明显优势，而顺序接种提高了乙酸酯和苯乙基类化合物的气味活性，尤其是SF2处理。根据来源于刺葡萄酒原料和乙醇发酵中各类气味成分的香气特征，CF和SF2处理酒样相比CK酒样有较好的果香和花香，其中CF果香更好，SF2花香更浓。
讨 论
本研究混合发酵处理显着影响了刺葡萄酒中香气成分的化学轮廓，并且对品种香气成分和发酵香气成分的影响作用有刺葡萄和接种方式的独特性。本研究中，混合发酵降低了萜烯类和C13-去甲类异戊二烯化合物的含量，这与先前在欧亚种葡萄中增香酿造的结果相悖。可能这两类物质的前体在刺葡萄中的含量比欧亚种葡萄少，混合发酵促进前体水解的游离态物质随发酵过程挥发损失，造成混合发酵酒样中这些物质的含量较低。混合发酵增加了刺葡萄酒中C6化合物和挥发性酚类的含量，并且增加幅度随Sc接种时间的延迟而加大。高含量的C6化合物常常是葡萄酒生青味的原因，较高含量的挥发性酚也会带给葡萄酒香气的负面效应，但累积OAV分析说明混合发酵对这两类物质的气味促进作用有限。刺葡萄酒中硫醇类物质含量较高，并且本研究中混合发酵提高了该类物质的含量。
本研究中，混合发酵虽然显着增加了刺葡萄酒中高级醇的含量，但总质量浓度低于300 mg/L，有6 种高级醇OAV大于0.1，说明Hu和Sc的混合发酵能够增强刺葡萄酒的醇香特征。酯类物质是葡萄酒中含量仅次于高级醇的发酵香气成分，本研究顺序接种处理显着提高了刺葡萄酒中乙酸酯的质量浓度，这是Hu菌株具有高产乙酸的特性所致。值得注意的是，混合发酵增加了刺葡萄酒中果香类短链脂肪酸乙酯的含量，却显着降低了中链脂肪酸乙酯的含量，尤其是顺序接种处理，这与Hu和Sc混合发酵在欧亚种葡萄酒处理中的结果相悖，这可能是刺葡萄品种本身的差异所引起的，值得深入研究。对于其他酯类，虽然混合发酵显着提高了乳酸乙酯和琥珀酸二乙酯的质量浓度，但由于其OAV较低，增加的幅度不足以影响香气质量。
本研究中，顺序接种处理酒样中的脂肪酸含量显着降低，而CF酒样中的含量却明显升高，并且所有处理中脂肪酸的质量浓度低于 5 mg/L。苯乙基类化合物通常具有玫瑰花的香气特征，对葡萄酒的香气质量可产生积极的影响。本研究中，优选菌株的混合发酵显着提高了苯乙基类化合物的含量，对刺葡萄酒香气质量的改善具有重要的促进作用。综合考虑刺葡萄酒的品种和发酵香气，相比于CK，CF和SF2处理对果香和花香类气味成分具有良好的促进作用。
总体上，刺葡萄酒中品种香气成分的总体质量浓度较低，而优选Hu和Sc混合发酵通过促进发酵香气成分的生成有利于刺葡萄酒香气质量的提升，且CF处理对果香类气味成分具有较好的促进作用，间隔48 h的顺序接种处理对花香类成分的促进效果更好。
