亚硝酸盐是香肠等腌制肉制品中常用的添加剂，亚硝酸根与肉类中的仲胺或叔胺反应会生成致癌、致畸和致突变的亚硝基化合物，加之其本身的毒性，因而应用受限。为此，科研人员进行了大量研究以期找出能够部分或完全替代肉制品中亚硝酸盐的天然替代物，但到目前为止，基于各种原因鲜见此类物质在肉制品中广泛应用。
目前，微生物发酵法替代肉制品中的亚硝酸盐是一个全新的研究领域，一些细菌可通过接种或本身存在于发酵肉制品中，除赋予发酵产品特殊风味和口感外，还可有效抑制有害菌的增殖生长。
东北农业大学食品学院的张欢、李沛军和孔保华*等人以产气荚膜梭菌替代肉毒梭状芽孢杆菌，拟以5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌作为受试菌株，通过混合培养以及条件培养，分别研究这些菌株及其发酵上清液对菌体本身生长、芽孢萌发与生长、芽孢形成的抑制作用，评价并筛选抑菌能力最强的目标菌株，同时探究抑菌机理，以期获得具有抑菌作用的发酵剂，为发酵肉制品的安全提供良好的保障。
1 单因素胁迫对冷冻干燥存活率的影响
1.1 混合培养
结果显示，各组乳酸菌数均升高至8（lg（CFU/mL））以上，且彼此间无显着性差异（P＞0.05），木糖葡萄球菌数生长到7.14（lg（CFU/mL））。通过对比可发现，植物乳杆菌组和清酒乳杆菌组中产气荚膜梭菌数最低，经培养后分别降低到5.62（lg（CFU/mL））和5.96（lg（CFU/mL）），而对照组中产气荚膜梭菌数为8.58（lg（CFU/mL）），表明这两株菌不仅抑制了产气荚膜梭菌的生长，且对其有一定的杀死作用。发酵乳杆菌、戊糖片球菌和弯曲乳杆菌组中产气荚膜梭菌数维持在6～7（lg（CFU/mL）），这表明这3 株乳酸菌对产气荚膜梭菌的生长具有一定的抑制作用，但对其几乎没有杀死能力。另外，木糖葡萄球菌组中产气荚膜梭菌数最高，达到7.88（lg（CFU/mL））。本实验结果表明乳酸菌的产酸能力与其抑菌能力密不可分。
1.2 条件培养
结果显示，经过24 h的厌氧培养，弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、发酵乳杆菌和植物乳杆菌组的发酵上清液pH值降至4.9～5.0之间，对应的产气荚膜梭菌生长受到强烈抑制；戊糖片球菌组和木糖葡萄球菌组pH值分别降为5.18和6.27，两组对应的产气荚膜梭菌细胞未受破坏，这表明乳酸菌代谢产生的有机酸是抑制产气荚膜梭菌增殖的关键因素。另外值得注意的是，植物乳杆菌组中并未发现产气荚膜梭菌的存在，这进一步表明，该组中除较低的pH值这一抑菌条件外，也存在其他的抑菌物质。
2 抑制产气荚膜梭菌芽孢萌发及生长分析
2.1 混合培养
结果显示，经过24 h的混合厌氧培养，各组受试菌株均生长良好。与对照组相比，在接种乳酸菌的体系中，产气荚膜梭菌芽孢萌发受到明显抑制，经过24 h的厌氧培养，菌数不超过 5.89（lg（CFU/mL）），这表明仅有少量的芽孢萌发并进行二次生长，而木糖葡萄球菌组中，产气荚膜梭菌的芽孢萌发并未受到抑制，其菌数达到了7.08（lg（CFU/mL））。这可能是乳酸菌在发酵的过程中产生了的机酸抑制了芽孢的萌发。
2.2 条件培养
结果显示，经过24 h的厌氧培养，多数乳酸菌处理组pH值降为4.9～5.0，戊糖片球菌组pH值为5.16，木糖葡萄球菌组最终pH值为6.21。在所有乳酸菌发酵得到的条件培养基中，产气荚膜梭菌芽孢萌发及生长受到了较强的抑制。木糖葡萄球菌处理组中，产气荚膜梭菌数达到了6.75（lg（CFU/mL）），虽略低于对照组，但考虑到菌株间的竞争作用，认为其并未对其芽孢的萌发及生长产生抑制作用。对比各组条件培养基pH值不难发现，产气荚膜梭菌芽孢的萌发和生长，与条件培养基的初始pH值有很大相关性。
3 抑制产气荚膜梭菌芽孢形成分析
3.1 混合培养
由于产气荚膜梭菌在形成芽孢时，会产生肠毒素，且其一旦形成芽孢，将更难以杀灭。因此，为研究不同菌株对产气荚膜梭菌芽孢形成的抑制作用，首先将6 株受试菌株与产气荚膜梭菌同时接种于mDS产芽孢培养基中混合培养，37 ℃厌氧培养24 h后，分别测定受试菌株数和产气荚膜梭菌芽孢数。由于mDS培养基中以高分子聚合物淀粉为碳源，各株受试乳酸菌对其利用效果很差，因此导致了乳酸菌生长缓慢，而未对产气荚膜梭菌芽孢形成有效的抑制作用；木糖葡萄球菌虽然有生长，但亦未观察到其对芽孢形成的抑制作用（数据未列出）。
3.2 条件培养
结果显示，经过48 h的厌氧培养，菌落计数结果显示，弯曲乳杆菌和清酒乳杆菌基本没有显示出生长迹象，其中活菌数有所下降，这表明二者不能利用淀粉作为其营养物质，因此，亦不能抑制产气荚膜梭菌芽孢的形成。发酵乳杆菌、植物乳杆菌和戊糖片球菌数稍有增长，相应培养基pH值也有所降低，其对应的条件培养基中未发现芽孢的生成。由于产气荚膜梭菌芽孢形成需要较高的pH值和不存在游离单糖两个条件，因此，这也就很好地解释了这3 株乳酸菌可以抑制其芽孢形成的现象。同样，尽管木糖葡萄球菌生长，但亦未观察到其对应条件培养基对芽孢形成有抑制作用。
4 抑菌机理分析
4.1 培养基pH值对产气荚膜梭菌和其芽孢萌发及生长的影响
4.1.1 培养基pH值对产气荚膜梭菌生长的影响
结果显示，随着培养基pH值下降，产气荚膜梭菌数亦呈现下降趋势。pH值下降是乳酸菌抑制产气荚膜梭菌生长的主要原因，而植物乳杆菌则可能存在其他途径抑制该病原菌的生长。随着pH值下降至5.0以下，产气荚膜梭菌显着降低（P＜0.05），这解释了在条件培养中多数乳酸菌抑制产气荚膜梭菌生长而戊糖片球菌对其抑制作用不明显的问题，同时也表明植物乳杆菌具备分泌某种抑菌物质的能力，可以使产气荚膜梭菌数降为0。
总之，乳酸菌发酵葡萄糖产酸降低培养基pH值是决定乳酸菌抑制产气荚膜梭菌生长的主要因素。另外，植物乳杆菌可能存在其他抑制产气荚膜梭菌生长的途径。
4.1.2 培养基pH值对产气荚膜梭菌芽孢萌发及生长的影响
结果显示，随着培养基pH值下降，产气荚膜梭菌菌数下降，表明低pH值是抑制产气荚膜梭菌芽孢萌发及二次生长的关键因素。乳酸菌发酵葡萄糖产酸降低培养基pH值是决定乳酸菌抑制产气荚膜梭菌芽孢萌发的最主要因素，而当芽孢一旦萌发，植物乳杆菌分泌的抑菌物质会协同低pH值作用，抑制其二次生长。
4.2 抑菌物质对产气荚膜梭菌生长的影响
经过对植物乳杆菌和弯曲乳杆菌进行24 h的厌氧发酵，两组mDS-G培养基pH值分别降低至4.91和4.93，表明二者发酵葡萄糖产酸水平总体相当。将两组培养基pH值调节至6.80后使用两种方式灭（除）菌，再同时向3 种培养基中接种产气荚膜梭菌。培养后计数结果显示，无论是加热杀死还是过滤除去条件菌，植物乳杆菌组均对产气荚膜梭菌均有更强的抑制作用（P＜0.05）。由于其pH值已经调节和对照组一致，因此，抑菌作用只能源自其分泌的抑菌物质，考虑到该抑菌物质的耐热性，推断其为植物乳杆菌分泌的细菌素。
而对于两组弯曲乳杆菌组（加热或过滤），产气荚膜梭菌落数均达到7.8（lg（CFU/mL））以上，略低于对照组的 8.14（lg（CFU/mL）），这可能是因为虽然处理组培养基pH值与对照组相同，但由于前期弯曲乳杆菌的生长，消耗了部分培养基营养成分所致。此外，对比条件培养实验结果可知，条件培养组中并未检测到产气荚膜梭菌活细胞，而本实验中将其pH值调回6.80后，测定其活细胞数为4（lg（CFU/mL））。这说明在条件培养中，较低pH值和细菌素的协同作用，抑制了产气荚膜梭菌生长。
结 论
5 株乳酸菌和1 株木糖葡萄球菌对产气荚膜梭菌增殖、芽孢生长及萌发、芽孢形成抑制作用不同，其中，植物乳杆菌对产气荚膜梭菌抑制能力最强，这是因为植物乳杆菌除产酸抑菌外，还可产生耐高温的细菌素，其他4 株乳酸菌效果次之，而木糖葡萄球菌无明显的抑制作用。研究为抑制产气荚膜梭菌增殖提供了解决方法，后续可以将本实验中具有良好抑菌作用的植物乳杆菌与前期研究得到的呈色菌种（发酵乳杆菌或木糖葡萄球菌）进行复配，应用于发酵肉制品中，为微生物发酵法部分替代亚硝酸盐提供一条很好的途径。
