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小米糠黄酮对H2O2致HepG2氧化应激损伤的保护作用

放大字体  缩小字体 发布日期:2020-05-11
核心提示:机体生长代谢过程中产生的自由基具有多种生理功能,如预防感染、激活细胞活性、传导信号等。
   机体生长代谢过程中产生的自由基具有多种生理功能,如预防感染、激活细胞活性、传导信号等。但是过多的自由基能导致机体正常的细胞组织发生病变并引起氧化应激反应,并促进癌症、动脉粥样硬化和糖尿病等疾病的病理学发展。因此,当机体受到外源性氧化物质攻击或内源性氧化损伤时,体内自由基产生和清除的动态平衡就会遭到破坏,从而会引起活性氧(ROS)在体内堆积并产生细胞毒性作用。
 
  为了系统准确地评价小米糠的抗氧化生物活性及其作用机制,东北农业大学食品学院的郭增旺、王中江*、江连洲*等人采用H2O2诱导HepG2细胞构建细胞氧化应激损伤模型,采用CCK-8检测细胞存活率,流式细胞仪检测胞内ROS水平,酶联免疫吸附测定法检测胞内抗氧化酶系活性,Western blotting法检测细胞凋亡通路蛋白表达量,以此评价小米糠黄酮(FMB)的抗氧化活性并探索其作用机理,从而为小米糠的功能性食品开发和抗氧化药物的研究提供理论依据。
 
  1、FMB对H2O2诱导HepG2细胞存活率的影响
 
  正常对照组:不加FMB和H2O2干预处理,只加入等量的PBS溶液;氧化应激模型组:不加FMB干预,加入等量的PBS溶液培养24 h后,加入终浓度为2 mmol/L H2O2溶液刺激1 h;实验组:FMB低、中、高剂量组(FMB-L、FMB-M、FMB-H,终质量浓度分别为50、100、150 μg/mL)干预24 h后,加入终浓度为2 mmol/L H2O2溶液刺激1 h。
 
  与正常组相比,H2O2构建的氧化应激模型组的细胞存活率显着下降(P<0.05),这表明氧化应激模型构建成功;与模型组相比,FMB中、高剂量组能显着提升细胞存活率(P<0.05),且呈现量效关系。这表明FMB对HepG2具有一定程度的保护作用,能缓解H2O2对HepG2的氧化应激损伤。
 
  2、FMB对H2O2诱导HepG2胞内ROS含量的影响
 
  与正常组相比,H2O2构建的氧化应激模型组的胞内ROS水平显着上升(P<0.05);与模型组相比,FMB-L、FMB-M、FMB-H组均能显着提升细胞存活率(P<0.05),且呈现剂量依赖性关系。这表明FMB能显着缓解H2O2所引起HepG2胞内ROS水平的升高,抑制ROS对细胞膜和胞内物质的氧化损伤,进而发挥抗氧化应激功能。
 
  3、FMB对H2O2诱导HepG2的MDA水平的影响
 
  与正常组相比,H2O2构建的氧化应激模型组的胞内MDA浓度显着上升(P<0.05);与模型组相比,FMB-L、FMB-M、FMB-H组能显着降低胞内MDA浓度(P<0.05),且呈现剂量依赖性关系。这表明HepG2细胞经H2O2诱导后细胞膜发生严重损伤,而FMB能显着缓解活性氧对细胞膜脂质氧化损伤的影响,能减轻自由基对机体的氧化应激损伤。
 
  4、FMB对H2O2诱导HepG2抗氧化物酶系活力的影响
 
  与正常组相比,H2O2构建的氧化应激模型组的抗氧化物酶系活力显着降低(P<0.05);与模型组相比,FMB-L组的CAT活力显着升高,FMB-M和FMB-H组的SOD、CAT、GSH-Px活力显着升高。这表明该浓度下的H2O2能破坏细胞的氧化调节系统,降低胞内抗氧化酶系的活力,致使胞内的氧化动态平衡失衡和胞内MDA水平上升,导致细胞发生不可逆的氧化损伤;同时也表明氧化应激模型构建成功;而FMB预培养后能缓解H2O2造成的胞内抗氧化物酶系活力降低并且降低胞内MDA水平,对氧化应激损伤有保护作用,能提高机体对外界氧化应激的调控能力。
 
  5、FMB对H2O2诱导HepG2的凋亡信号通路影响
 
  与正常组相比,H2O2构建的氧化应激模型组的bax、p53和Caspase-3蛋白的表达量均显着上升(P<0.05);与模型组相比,FMB-L组的p53和Caspase-3蛋白表达量显着下降(P<0.05),FMB-M和FMB-H组的bax、p53和Caspase-3蛋白显着下降(P<0.05)。结合前面实验结果可知,该浓度下的H2O2能使细胞存活率降低,并且使胞内凋亡蛋白bax、p53和Caspase-3表达量显着升高。bax凋亡蛋白的水平上升表示细胞的线粒体凋亡通路被激活,线粒体遭受到氧化应激损伤;p53凋亡蛋白的表达量上升代表DNA发生损伤后,细胞进行自我基因修复,当损伤不可修复时则激活Caspase-3凋亡蛋白的表达,而Caspase-3蛋白是细胞发生凋亡的最终执行者。这表明H2O2能激活细胞线粒体凋亡通路和Caspase-3凋亡通路,进而导致细胞存活率下降。
 
  结 论
 
  结果表明:FMB能显着缓解H2O2引起的HepG2细胞存活率的降低和胞内ROS、MDA水平的升高,恢复抗氧化酶系酶活力和下调bax、p53和Caspase-3凋亡蛋白的表达量。这表明FMB能通过抑制细胞凋亡通路蛋白的表达,调控细胞的氧化还原系统、清除胞内活性氧、提高胞内抗氧化酶系的活性,缓解氧化应激对机体所造成的损伤,增强机体对外界氧化应激的调控能力。
 
 
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