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黄酒混浊蛋白组成成分及来源分析

放大字体  缩小字体 发布日期:2020-06-15
核心提示:黄酒混浊是黄酒在贮存过程中常见的问题之一,严重影响黄酒的外观品质和销售。
   黄酒混浊是黄酒在贮存过程中常见的问题之一,严重影响黄酒的外观品质和销售。黄酒混浊分为生物混浊和非生物混浊。从形成的机理来说,非生物混浊可以分为蛋白质混浊、金属离子混浊、氧化混浊、酱色混浊和糊精混浊。在贮存的过程中,黄酒中的蛋白质容易形成混浊。黄酒的酿造原料主要为稻米(糯米、粳米、籼米)、黍米等,经浸泡、蒸煮、加酒曲、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒(除菌)、贮存、勾兑而成。从原料及工艺可分析出,其酒体中的蛋白质来源主要为稻米和麦曲,因此通过分析发酵过程中蛋白质的变化可为后续分析黄酒混浊中蛋白质的来源提供一定理论基础。
 
  浙江树人大学生物与环境工程学院的谢广发和江南大学生物工程学院的樊世英、孙军勇*等人通过双向电泳以及基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱(MALDI-TOFMS)对黄酒沉淀中的蛋白质进行分离与鉴定,确定黄酒混浊沉淀中蛋白质的种类。并采用N-三(羟甲基)甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine SDS-PAGE)分析不同发酵时间发酵液中蛋白质分布情况,以期从发酵过程解释黄酒混浊蛋白的来源情况,为解决黄酒蛋白质混浊提供新的思路。
 
  1 黄酒混浊蛋白的双向电泳分析
 
  通过对不同样品进行离心去杂、TCA-丙酮沉淀获得蛋白样品,使用7 cm、pH 3~10、非线性的IPG胶条进行双向电泳实验,获得的双向电泳图谱见图1。结果表明,不同瓶装黄酒中混浊蛋白的分布基本相近,主要分为酸性蛋白区和低分子碱性蛋白区。
 
  2 黄酒混浊蛋白的MALDI-TOF-MS分析
 
  通过质谱鉴定结果发现,碱性端的蛋白主要为类燕麦蛋白和水稻的假定蛋白,酸性端的蛋白为二聚α-淀粉酶抑制剂。类燕麦蛋白是小麦的贮存蛋白,分为A亚型和B亚型2 种蛋白质。A亚型蛋白质含有168 个氨基酸,其中谷氨酸数量为36 个,占氨基酸总量的21%,B亚型蛋白质含有284 个氨基酸,其中谷氨酸数量为80 个,占氨基酸总量的28%。类燕麦蛋白前体是形成燕麦蛋白的前体蛋白,含有181 个氨基酸,其中谷氨酸含量为44 个,占氨基酸总量的24%。
 
  这些蛋白中含大量谷氨酸,与氨基酸分析中谷氨酸含量偏高相符合,说明黄酒混浊中谷氨酸含量偏高与小麦的类燕麦蛋白有关。类燕麦蛋白含有一定数目的半胱氨酸,存在分子内和分子间的二硫键,可以形成高分子聚合体,对混浊形成有重要影响。研究发现类燕麦蛋白来源于小麦胚乳,属于低分子质量谷蛋白,对小麦的加工品质有重要影响。
 
  对鉴定结果中不同来源的蛋白点进行简单统计,结果显示,在33 个蛋白点中来源于小麦的有21 个蛋白点,水稻的有12 个蛋白点,小麦蛋白在混浊蛋白中占有较大比重。来源于小麦的混浊蛋白有5 种,分别为类燕麦蛋白A、类燕麦蛋白B、类燕麦蛋白前体、二聚α-淀粉酶抑制剂、胰蛋白酶前体,以二聚α-淀粉酶抑制剂、类燕麦蛋白前体为主,来源于水稻的混浊蛋白有3 种,分别为假定蛋白OSJ_04535、假定蛋白OSI_17439和蛋白H0313F03.18,以2 种假定蛋白为主。
 
  研究发现α-淀粉酶抑制剂在pH 4~11时性质稳定,在80 ℃作用30 min后活性仅降低10%左右,由于热稳定性强,在黄酒加热杀菌过程中,α-淀粉酶抑制剂没有失活变性,仍会残留在酒液中,在贮存过程中因为外界环境的变化导致其逐渐析出形成混浊。
 
  有5 种混浊蛋白来源于小麦,说明小麦对黄酒蛋白质混浊有重要影响。小麦自身含有的α-淀粉酶抑制剂在发酵过程中会抑制淀粉酶活性,导致淀粉分解不彻底,部分糊精会残留在酒液中,随着环境变化糊精会析出,加重黄酒的非生物混浊,但对于其具体的作用过程还需要进一步研究。假定蛋白是功能未知的蛋白,对于水稻中鉴定出的假定蛋白,对其功能以及在混浊形成过程中的作用还有待研究。
 
  3 黄酒混浊蛋白质Tricine-SDS-PAGE分析
 
  对混浊蛋白、发酵原料(生麦曲、熟麦曲、大米)及酿造过程中的发酵液进行Tricine-SDS-PAGE分析,结果见图2。泳道1的混浊蛋白有两条比较明显的条带,经软件计算分子质量分别约为14.1 kDa和27.6 kDa,对2 个条带所占混浊蛋白的百分含量进行积分光密度计算,分别为75.4%和24.6%。从图2可以看出,在麦曲和大米中存在与混浊蛋白分子质量一致的27.6 kDa的蛋白质,说明分子质量在27.6 kDa左右的混浊蛋白质主要来源于麦曲和大米,14.6 kDa的条带存在于混浊蛋白和麦曲中,因此麦曲是分子质量14.6 kDa左右混浊蛋白的主要来源。
 
  在黄酒发酵的前2 d,原料中的大部分蛋白质溶于发酵液中,主要包括5.6~14.4、23.5、27.6~35.0 kDa和55.4kDa的蛋白质,从第3天开始,发酵液中的蛋白质变化较为明显,分子质量8.0 kDa以下的小分子蛋白质显着减少,直至完全消失,8.0~14.4、23.5 kDa和35 kDa的蛋白质也随着发酵时间的推移逐渐减少,当发酵结束后完全消失。
 
  在第21天的发酵液中,仅存在5 个条带,标记为a~e,其中a、d、e 3 个条带在发酵过程中被降解逐渐减少,而b和c两个条带的刚开始发酵时含量较低,但在发酵过程中并未减少,一直存留至发酵结束,这说明b和c这2 个条带所含有的蛋白质难以被降解,而条带c也是组成混浊蛋白的主要蛋白质。经MALDI-TOF-MS鉴定,条带a~e分别为β-淀粉酶、木聚糖酶抑制蛋白I、几丁质酶II、α-淀粉酶抑制剂、病程相关蛋白,除了木聚糖酶抑制蛋白I之外,其他几种蛋白质都在混浊蛋白中出现,由此可见,原料带入发酵过程的未完全降解的蛋白质为蛋白质混浊提供了物质基础。
 
  结    论
 
  黄酒混浊蛋白主要分布为酸性蛋白区和低分子碱性蛋白区,质谱鉴定发现黄酒的混浊蛋白主要来源于小麦和水稻,分子质量在13~37 kDa之间,其中5 种来源于小麦,包括富含谷氨酸的类燕麦蛋白A、类燕麦蛋白B和类燕麦蛋白前体,还有二聚α-淀粉酶抑制剂和胰蛋白酶前体,来源于水稻的假定蛋白OSJ_04535、假定蛋白OSI_17439和蛋白H0313F03.18。这些蛋白共同构成了黄酒的混浊蛋白。
 
  Tricine-SDS-PAGE分析发现混浊蛋白的分子质量约为14.1 kDa和27.6 kDa,占比分别为75.4%和24.6%。在黄酒酿造过程中,原料中的蛋白质种类随着发酵时间延长逐渐减少,黄酒中蛋白质的条带越来越少,但与混浊蛋白质分子质量一致的条带始终存在,这说明黄酒混浊蛋白质主要来源于黄酒酿造原料麦曲和大米,这与质谱鉴定的结果一致,并且在黄酒的酿造过程中一直存留于发酵液中。因此,对黄酒原料或工艺进行优化,减少发酵过程中混浊蛋白的含量,可以有效地控制黄酒的蛋白质混浊。
 
 
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