北京联合大学生物化学工程学院的杜月梅、韩何丹和高丽萍*等人运用cDDP造模，通过测定GSPE对cDDP所致TM4细胞凋亡及凋亡相关蛋 白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达量的影响，探究GSPE对cDDP所致TM4细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。以期为GSPE应用于临床提供实验依据，为男性癌症患者提供有效的化疗辅助品及减少cDDP应用于临床化疗的局限性。
1 cDDP对TM4细胞生长的抑制作用
用不同质量浓度的cDDP处理TM4细胞24 h，结果显示，随着cDDP终质量浓度的增大，对TM4细胞的抑制率逐渐升高，各质量浓度cDDP对TM4细胞抑制率与空白对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.01）。cDDP对TM4细胞IC50为（0.014 0±0.000 3）mg/mL，因此选择0.014 mg/mL质量浓度的cDDP用于后续实验。
2 GSPE对TM4细胞生长的影响
结果显示，随GSPE终质量浓度的升高，TM4细胞存活率逐渐增高，在GSPE终质量浓度为0.010 mg/mL时，TM4细胞存活率达到最高，此后随GSPE终质量浓度增加，TM4细胞存活率逐渐降低。当GSPE终质量浓度高于0.500 mg/mL时，TM4细胞存活率显着低于空白对照组，即高质量浓度GSPE对TM4细胞生长具抑制作用。不同终质量浓度GSPE对TM4细胞存活率与空白对照组（GSPE终质量浓度为0 mg/mL）相比，存在极显着差异（P<0.01）。由此数据计算得到GSPE单独作用24 h对TM4细胞的IC50为（0.956 0±0.001 2）mg/mL。
3 GSPE对cDDP诱导TM4细胞毒性的保护作用
用终质量浓度为0.014 mg/mL的cDDP建立TM4细胞损伤模型，用不同终质量浓度的GSPE提前24 h处理TM4细胞。结果显示，与cDDP模型组对比，cDDP+GSPE组细胞存活率极显着提高（P<0.01），但随着GSPE质量浓度的升高，细胞存活率先升高后降低。这表明cDDP对TM4细胞有明显的抑制作用，而在一定质量浓度范围内，GSPE对cDDP所致细胞损伤具有明显的保护作用，0.005 mg/mL的GSPE保护效果最佳。
4 各组TM4细胞凋亡率变化
由图4可知，cDDP可造成TM4细胞各时期凋亡率及死亡率升高，与空白对照组相比较具有极显着性差异；若细胞先经GSPE提前作用2 h，再由cDDP诱导作用24 h，则此时TM4细胞凋亡率增高的程度明显降低，表明终质量浓度为0.005 mg/mL的GSPE对0.014 mg/mL的cDDP所诱导TM4细胞凋亡具有很好的拮抗作用，对TM4细胞起到保护作用，提示GSPE可能参与调控cDDP诱导的TM4细胞的凋亡途径。
5 各组TM4细胞凋亡形态变化
由图5可知，空白对照组细胞呈疏散状，发出均匀荧光，荧光亮度较浅，呈浅蓝色；cDDP模型组多数细胞变圆、与临近细胞相分离，大量细胞已脱壁，贴壁细胞数目明显减少，细胞核出现致密浓染的颗粒状高亮荧光物，荧光强度与正常细胞相比较明显增强，凋亡细胞明显增多；GSPE对照组细胞贴壁紧密，细胞呈均匀浅蓝色荧光，其染色形态与空白对照组相似，无明显变化；GSPE+cDDP实验组细胞脱壁现象较cDDP模型组明显减少，细胞多数贴壁生长，胞体变圆现象远少于cDDP模型组，与cDDP模型组相比较细胞核出现致密浓染的颗粒状荧光明显减少。结果表明，终质量浓度为0.005 mg/mL的GSPE对0.014 mg/mL的cDDP所诱导TM4细胞凋亡形态学改变具有很好的拮抗作用。
6 各组TM4细胞凋亡相关蛋白表达的变化
如图6、7所示，终质量浓度为0.014 mg/mL的cDDP作用于TM4细胞24 h后，细胞内Bcl-2相对表达量（28.91±1.07）%与空白对照组（52.30±3.14）%相比显着降低（P<0.01）；若细胞先经GSPE提前作用2 h，再由cDDP诱导作用24 h，则此时细胞内Bcl-2相对表达量（（38.43±1.12）%）与cDDP模型组相比极显着升高（P<0.01）；0.005 mg/mL的GSPE单独作用于TM4细胞，其细胞内Bcl-2相对表达量（54.92±2.81）%与正常TM4细胞内Bcl-2相对表达量不存在显着性差异。
如图6、8所示，终质量浓度为0.014 mg/mL的cDDP作用于TM4细胞24 h后，细胞内Bax相对表达量（73.82±4.53）%与空白对照组（10.73±0.26）%相比极显着增高（P<0.01）;若细胞先经GSPE提前作用2 h，再由cDDP诱导作用24 h，则此时细胞内Bax相对表达量（36.44±3.13）%与cDDP模型组相比极显着降低（P<0.01）；0.005 mg/mL的GSPE单独作用于TM4细胞，其细胞内Bax相对表达量（（9.75±1.42）%）与正常TM4细胞内Bax相对表达量不存在显着性差异。
如图6、9所示，终质量浓度为0.014 mg/mL的cDDP作用于TM4细胞24 h后，细胞内Pro-caspase 3相对表达量（31.13±0.94）%与空白对照组（70.21±2.82）%相比极显着降低（P<0.01）；若细胞先经GSPE提前作用2 h，再由cDDP诱导作用24 h，则此时细胞内Pro-caspase 3相对表达量（40.36±2.43）%与cDDP模型组相比极显着升高（P<0.01）；0.005 mg/mL的GSPE单独作用于TM4细胞，其细胞内Pro-caspase 3相对表达量（（74.93±3.25）%）与正常TM4细胞内Bax相对表达量不存在显着性差异。
如图6、10所示，终质量浓度为0.014 mg/mL的cDDP作用于TM4细胞24 h后，细胞内Caspase-3相对表达量（27.35±1.54）%与空白对照组（13.76±0.71）%相比极显着增高（P<0.01）；若细胞先经GSPE提前作用2 h，再由cDDP诱导作用24 h，则此时细胞内Caspase-3相对表达量（15.64±0.86）%与cDDP模型组相比极显着降低（P<0.01）；0.005 mg/mL的GSPE单独作用于TM4细胞，其细胞内Caspase-3相对表达量（（14.37±0.33）%）与正常TM4细胞内Caspase-3相对表达量不存在显着性差异。
GSPE对cDDP诱导的TM4细胞各蛋白表达变化情况结果表明，GSPE（0.005 mg/mL）可有效拮抗cDDP（0.014 mg/mL）诱导TM4细胞细胞凋亡，显着增强Bcl-2、Pro-caspase 3表达，极显着抑制Bax、Caspase-3表达（P<0.01）；0.005 mg/mL GSPE单独作用于TM4细胞，其细胞内各基因表达量与正常TM4细胞内基因表达量均不存在显着性差异。
讨 论
本研究结果显示，当GSPE终质量浓度浓度为0.005 mg/mL时，对cDDP诱导的TM4细胞毒性有明显的抑制作用。本研究结果也显示，cDDP可显着促进TM4细胞的凋亡。
本研究从细胞凋亡角度进一步探究GSPE对cDDP所致TM4细胞毒性作用的影响，研究结果显示GSPE可明显抑制cDDP诱发的小鼠睾丸支持细胞凋亡，同时cDDP单独用药后，TM4细胞内Bcl-2相对表达量以及处于酶原状态Pro-caspase 3的相对表达量显着降低，而Bax和处于激活状态的Caspase-3相对表达量明显增加，提示Bcl-2、Bax、Caspase-3等基因参与cDDP诱导TM4细胞凋亡，细胞凋亡在cDDP诱导TM4细胞毒性过程中起重要作用。GSPE拮抗因cDDP诱导的细胞凋亡其确切的分子机制目前仍不明确，其中一个可能的解释即为GSPE对凋亡相关基因表达的影响。本研究结果显示GSPE可明显降低Bax以及Caspase-3的蛋白表达量，增加Bcl-2和Pro-caspase 3的蛋白表达量，阻抑cDDP诱导TM4细胞的凋亡。
综上所述，GSPE提前作用TM4细胞后，对cDDP诱导的细胞毒性损伤有保护作用，其机制可能通过上调Bcl-2蛋白表达、下调Bax及Caspase-3的蛋白表达，从而发挥抗细胞凋亡作用而实现的。
