土鸡蛋，是不少消费者非常推崇的鸡蛋种类之一。而在挑选土鸡蛋的时候，消费者往往有这样的经验——蛋壳越红，品质越高。其实，鸡蛋蛋壳和蛋黄的颜色，来源于母鸡饲料中的类胡萝卜素物质，这类物质含量越高，鸡蛋的颜色越红。因此，有不少养殖户选择添加类胡萝卜素物质来改善鸡蛋的颜色。
“斑蝥黄”就是其中一种，又名角黄素，是一种天然存在于甲壳、鱼类、藻类等生物体内的类胡萝卜素。它是一种橙红色的色素，稳定性比较好，常用于饮料、酱料、肉类等食物的
调色，可让蛋黄颜色更鲜红，让动物肉的色泽更红润。
在目前的相关国标中，对于斑蝥黄的添加和使用进行了规定，《饲料添加剂安全使用规范》中明文规定，斑蝥黄可以作为着色剂被生产需要适量用于家禽，在肉禽配合饲料和蛋禽配合饲料中的最高限量为25mg/kg、8mg/kg。国标中也提供了两种检测方法——LC-UV和LC-MS/MS。本文就介绍了一种更高效的LC-MS/MS的方法，即使用Waters ACQUITY UPLC接Quattro Premier XE质谱实现LC-MS/MS的方法。
样品处理方法参照SN/T 2327-2009执行，使用液液萃取净化，同时结合Xevo TQ-S Micro的高灵敏度，使用了溶剂稀释方法，避免了标准当中长时间的浓缩过程带来的回收率损失。ACQUITY UPLC I-Class建立高效的分离方法，斑蝥黄反式、顺式异构体的保留时间分别约为2.60min、2.89min，标准品色谱图见图1,检测结果采用基质匹配外标法定量，分析鸡蛋中的斑蝥黄。测试了系统重现性和样品加标回收率，并对实际样品中的斑蝥黄含量进行检测。
图1. 斑蝥黄标准品(MRM)色谱图。
实验方法
超高效液相色谱分离条件
色谱系统: ACQUITY UPLC I-Class
色谱柱: ACQUITY UPLC BEH C18， 2.1 x 50mm，1.7μm
柱温: 45 ˚C
流速: 0.5 mL/min
流动相A: 含有0.1%甲酸的水溶液
流动相B: 含有0.1%甲酸的乙腈溶液
运行时间: 4 min
进样量: 1 μL
表1. 流动相梯度。
质谱条件
质谱系统: Xevo TQ-S Micro
电离模式: ESI+
电喷雾电压: 3.5 kv
脱溶剂气温度: 500 ˚C
离子源温度: 150 ˚C
脱溶剂气流速: 1000 L/hr
锥孔气流速: 70 L/hr
表2.斑蝥黄MRM条件。
样品制备
样品处理流程参照SN/T 2327-2009执行。
取生鸡蛋煮熟，冷却后剥开并搅碎，作为待测样品；
准确称取样品1.00g至50 mL离心管，加入标准品后搅拌并静止1小时；准确加入15 mL乙腈并漩涡1分钟；转移到离心机并10000转/分钟离心5分钟；
取5 mL上清液混入5 mL正己烷，漩涡1分钟。10000转/分钟离心5分钟；取适量下层乙腈溶液过0.45 μm滤膜，取滤液1 mL上LC-MS/MS测试
实验结果
回收率测试
取鸡蛋样品进行添加回收率测定，分别添加20.0 μg/kg和2.0 μg/kg两个浓度水平。按所建立的方法进行样品处理及测定，空白基质匹配标准曲线，外标法定量。高、低添加水平的回收率分别为95.9%和68.1%。
基质匹配校准曲线及重现性
用空白基质配置斑蝥黄标准曲线，线性范围0.01-10.0 μg/L，标准曲线测试重复性，每个浓度点重复测试9次，线性相关系数r2=0.9994,标准曲线各点%Dev<20%， 符合定量要求。
图2. 斑蝥黄定量结果。
按本方法对随机购买市售鸡蛋样品进行了检测，检出了含量0.70 μg/kg的斑蝥黄。
图3. 鸡蛋中含量0.70 μg/kg的斑蝥黄色谱图。
实验结论
在标准SN/T 2327-2009中使用ACQUITY UPLC接Quattro Premier XE质谱检测斑蝥黄的基础上，使用ACQUITY UPLC I-Class系统连接Xevo TQ-S micro对方法进行验证。证明了该方法在Waters更多设备上的适用性。
采用液液萃取结合溶剂稀释法对样品进行处理，无需氮吹，省时省力。Xevo TQ-S micro的高灵敏度保证了检出结果的准确性。
ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱运行仅需时间4 min即可完成方法检测，大大提升了检测的效率。
