（一）蛋白酶K广泛应用于日常检测及科研实验中，为核酸提取实验中的必备试剂。
蛋白酶K由于能够消化角蛋白（kratin）因此被命名为蛋白酶K。蛋白酶K家族包含了各种由真菌、酵母及革兰氏阴性细菌分泌的细胞内肽酶，其中细菌分泌的酶有高度的序列相似性（>55%）。林伯氏白色念球菌（Tritirachiumalbum Limber）分泌产生蛋白酶K是该家族的模式蛋白。蛋白酶K对大多数底物均有切割活性，但是偏好于带有脂肪族及芳香烃的肽链。其属于丝氨酸蛋白酶，拥有典型的丝氨酸活性位点：Asp39–His69–Ser224 。其含有一个单练肽链包含277氨基酸位点，并拥有2个二硫键和一个空置的半胱氨酸位点以及两个钙离子结合位点。
蛋白酶K的应用主要为核酸提取时去除DNA酶和RNA酶，并且可将结合于基因组上的组蛋白去除，还可用于碱性磷酸酶的失活。目前分子生物学技术已应用于许多检测标准中，例如转基因检测、动物属性检测、致病微生物检测等。在分子生物学检测中核酸的提取质量直接影响了后续PCR反应的扩增效率。许多标准在核酸提取步骤中都设立了添加蛋白酶K消化的步骤，以期提取较纯的核酸。为了保护核酸，分子生物学核酸提取实验中通常含有EDTA等试剂，由于EDTA可以与金属离子络合，因此可能会导致酶活性受到影响；并且通常为pH8.0时和55℃条件下进行消化，不同pH值和温度条件会使得酶活性受到影响。
（二）生化制剂蛋白酶K缺乏专门适用的检测标准，急需建立统一的活性检测方法标准。
对于生化试剂蛋白酶K目前在国内外均无专门的检测标准，对于蛋白酶活性检测国内标准目前有SB/T10317-1999《蛋白酶活力测定法》和GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》。然而由于其检测活性时所使用的条件均与分子生物学使用条件相差较大，且分子生物学实验使用的酶活性纯度均比工业酶大，因此还需要进一步对检测方法进行规范和调整。由于没有统一的蛋白酶K活性检测方法，各个厂家都规定了各自的酶活性单位定义，有于37℃下的以及40℃下测量的，反应底物也有酪蛋白、牛血红蛋白、人工合成底物等，而核酸提取实验中仅要求使用20mg/mL的酶，也并未规定其所使用的酶活性单位，因此会导致所使用的酶量不同，而对核酸的消化反应程度不同，可能对后续试验有所影响。
为什么以酪氨酸比色测定法作为标准方法
对于蛋白酶制剂活性检测国内标准目前有SB/T10317-1999《蛋白酶活力测定法》和GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》。
两个标准均采用了目前测蛋白酶活性最广泛应用的福林酚（Lowry）法，其原理为福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化台物还原呈蓝色（铝蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下与酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用碳酸钠碱化，再加入福林一酚试剂显色。蓝色的深浅与滤液中生成物酪氨酸量成正比；酪氨酸含量用分光光度计在660nm 波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。由于福林酚试剂与苯酚基都能形成蓝色络合物，以至使柠檬酸、单宁等对此法均有干扰；样品中若含有乙醇（最大含量为5%）、乙醚（最大含量为5%）、丙酮（最大含量为0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时必需做校正曲线，这样就使该法的应用受到局限。
GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》中对于蛋白酶活性检测第二法为紫外分光光度法，其将福林酚法进行改进，在其基础上去除了加三氯醋酸沉淀过滤后加福林酚显色试剂的步骤，改为直接测滤液275nm处吸光度值，该方法更为方便快捷。然而由于其检测的活性时所使用的条件均与分子生物学时使用条件相差较大，且分子生物学实验使用的酶活性纯度均比工业酶大，因此还需要进一步对检测方法进行规范和调整。
目前对于蛋白酶的检测方法也有许多新方法涌现：凝胶电泳法、DNA/溴乙锭荧光分析法、流动注射分析法。凝胶电泳法是基于酶的相对分子质量的。凝胶电泳法无法区别具有酶活性以及失去酶活性的蛋白酶K。
DNA/溴乙锭荧光分析法原理为：组蛋白与DNA 有非常高的亲和力，组蛋白加入双链DNA 溶液时全部结合到DNA 双链上，加入蛋白酶时水解结合在DNA 链上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA 双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。DNA/溴乙锭荧光分析法则只测试了蛋白酶K的一部分酶活功能，并且对仪器的灵敏度要求高，普通实验室难以达到此类要求，所使用的荧光试剂价格昂贵并且其对人体的损害情况未知。
流动注射分析法原理为：用荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记蛋白酶底物牛血清白蛋白（BSA ），然后将标记的BSA偶联到22F212甲基吡啶（FMP）活化的分离胶上制成分析柱，当酶液流过分析柱时，蛋白酶将标记在BSA上的荧光基团解离下来，通过荧光光度计检测酶解流出液的荧光强度来测定蛋白酶的活性。流动注射分析法所操作的步骤繁琐，也不适用于日常检测。
蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可催化含有较多的丝氨酸位点的α-酪蛋白水解。本标准方法首先通过测量各个浓度的L－酪氨酸标准溶液在275nm处的吸光度值，并构建标准曲线得出线性回归方程计算吸光常数K值。再以α-酪蛋白为反应底物，通过蛋白酶K催化水解α-酪蛋白产生酪氨酸，加入三氯乙酸终止酶反应，过滤去未水解的酪蛋白沉淀，测量滤液在275nm处的吸光度值，通过公式换算得出样品的酶活性单位。该方法操作简单，仪器通用，易于推广。
标准适用范围
本标准仅适用于生化试剂中蛋白酶K的测定，其他样品基质可能会对本方法产生影响。
标准关键注意事项
１、酪蛋白溶液长时间放置可能会染菌，因此建议配置后两周内使用。
２、L－酪氨酸容易吸水，必须于105℃干燥至恒重后使用。底物onPG 在溶液状态下稳定性较差，必须现配现用。
３、酶活性测试时样液酶活浓度和催化比色的吸光度并不完全线性相关，因此必须到标准所规定的浓度范围内进行测试。在该标准中，即为所未定的K值范围内。
４、温度对测试结果影响较大，所以测试前所用的试剂需要在标准规定的温度下恒温预热。
