辣根过氧化物酶是来源于辣根的氧化还原酶，其以过氧化氢为电子受体催化底物氧化。主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以高血红素为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。辣根过氧化物酶自1966年被列为抗体的标记物以来，其应用日益广泛，是免疫细胞（组织）化学和酶免疫测定（ELISA）等技术中最常用的标记酶之一。目前在蛋白质、多糖、激素、病毒、寄生虫等方面多有应用，具有特异性强、灵敏度高的优点。此外，七十年代初期辣根过氧化物酶又被引入作为观察轴突逆行传递的试剂，为研究神经系统提供了一项新技术。辣根过氧化物酶的活性将直接影响上述各类工作的实验效果。而对于酶活的测定，由于缺乏统一的标准，各个厂商的分析方法都不尽相同。并且其酶活力单位是否和厂家说明中标识的酶活力单位一致还缺乏相关的标准进行规范约束和验证。这使得市场上辣根过氧化物酶的质量难以得到保证，也使得在进行生化实验中也难以确保实验数据的重复性，科学性和准确性。因此需要制定辣根过氧化物酶活性测定标准。
为什么以愈创木酚为氢供体的分光光度法作为标准方法
各文献报道和辣根过氧化物酶生产厂商通常采用分光光度法测定酶活力。辣根过氧化物酶是以高铁血红素为辅基的糖蛋白，它有几十个同工酶，在过氧化氢存在下，它们都可以氧化多种酚类和胺类化合物，最终形成有色产物，对其催化产物进行定量从而计算酶活力。国内外关于辣根过氧化物酶活力的测定方法均基于此原理。由于酶的催化氢供体底物的选择不同，目前常用的辣根过氧化物酶测定主要有以下几种方法：
（1）邻苯三酚法
该方法是最为经典的辣根过氧化物酶检测方法，以邻苯三酚作为氢供体，由Willstalter于1917年首先报道。辣根过氧化物酶可将邻苯三酚催化氧化为红棓酚。该产物在420nm处有最大吸收。Sigma、Merck等公司一直沿用该方法测定辣根过氧化物酶活性。Sigma和Merck公司对辣根过氧化物酶酶活力单位的定义为：20℃、pH6.0时，每20秒催化生成1mg红棓酚为一个酶活性单位。但邻苯三酚容易自氧化，所以方法的稳定性和抗基质干扰能力较差，而且需要进行空白试验，操作较为繁琐。
（2） o-邻联茴香胺法
为解决邻苯三酚自氧化的弊端，o-邻联茴香胺为氢供体底物被应用于辣根过氧化物酶活性测定。该方法以辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化o-邻联茴香胺为反应原理，规定在25℃、pH7.0、470nm波长下，每分钟吸光度变化0.001为一个活力单位。由于o-邻联茴香不易发生自氧化，所以该方法的稳定性要高于邻苯三酚法。但o-邻联茴香胺具有潜在的致癌性，目前已逐渐被其他氢供体试剂所取代。
（3）联苯胺法
在3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）还没被广泛运用之前，联苯胺作一直是酶联免疫方法辣根过氧化物酶催化反应的最重要底物。其能被过氧化物酶迅速氧化，生成蓝色的物质，反应灵敏。但和o-邻联茴香胺一样，随着其致癌性被报道，使用的安全性被广泛关注，已逐步被弃用。
（4） 4-氨基安替比林法
1966年Trinder提出该方法作为辣根过氧化物酶活性测定方法。其以4-氨基安替比林为氢供体，规定在25℃、pH7.0时，每分钟催化转化一个微摩尔过氧化氢的酶量为一个酶活性单位。这也是酶活力国际单位的定义。其优点在于4-氨基安替比林是稳定的氢供体，方法重复性好。该方法为Worthington公司所采用。其氧化产物安替比林醌亚胺染料为红棕色，和高浓度的辣根过氧化物酶本身的颜色相近。为防止基质干扰，测定前需对样品进行一定程度的稀释，导致灵敏度较差。
（5）愈创木酚法
Bergmeyer于1974年报道了该方法在辣根过氧化物酶活性测定中的应用，其以愈创木酚为氢供体，对酶活力单位的定义和4-氨基安替比林相同。该方法不仅仅用于辣根过氧化物酶的测定，国内外众多篇文献还将其运用于各种植物中过氧化物酶活性的测定，如玉米、番茄、荞麦、洋葱，豆壳等等。其突出的优势在于抗干扰能力好，并且愈创木酚毒性较小且化学性质稳定，在过氧化物酶存在的条件下，能被过氧化氢氧化为四邻甲氧基连酚。但其氧化速率较上述方法偏低，故测试时间稍长，需2-3分钟。
（6）银离子标准曲线法
该方法是愈创木酚法的改进法，由于愈创木酚的辣根过氧化物酶催化底物——四邻甲氧基连酚不易购买，所以无法通过标准曲线对其定量，只能通过摩尔消光系数计算其含量，结果的重复性会受一定影响。而在有银离子存在时，愈创木酚也能被过氧化物氧化成四邻甲氧基连酚，故可形成一条以银离子浓度为横坐标，以吸光度变化值为纵坐标的标准曲线。通过标准曲线上银离子的量即可换算出酶活力。但是此方法过于麻烦，而且银离子和酶的催化氧化并不完全线性相关，故其结果有一定的不准确性。
（7）酸终止法
为弥补过氧化物酶催化反应速率快、不易于大批量样品进行高通量测定的缺点。Jorg提出在酶反应一定时间后，使用酸终止酶的反应再进行测定的方法。使用的酸包括磷酸、醋酸、三氯乙酸、磷酸等。但是终止后反应体系的颜色会发生改变，例如联苯胺的酶催化氧化经酸终止后会由蓝色变为黄色，不利于推算出酶活力国际单位。目前主要被应用于酶联免疫分析，关于酶活力测定的报道较少。
综合以上各方法的优缺点，在本标准中采纳了愈创木酚为氢供体的分光光度法为酶活性检测方法，并采用在25℃、pH7.0时，每分钟催化转化一个微摩尔过氧化氢的酶量为一个酶活性单位作为辣根过氧化物酶酶活力的定义。该方法采用的试剂安全，操作简便，重现性好，所使用的仪器紫外分光光度计为目前国内各大实验室必备的检测仪器，可以方便标准检测的实施。
标准适用范围
过氧化物酶种类众多，每种酶的酶学性质都有所不同，本标准仅仅适用于从辣根中分离提纯的科研或工业过氧化物酶制剂的检测。
标准关键注意事项
１、辣根过氧化物酶遇光易失活，因此样品因避光保存。
２、愈创木酚溶液状态下容易自氧化，过氧化氢水溶液稳定性较差，因此这两种溶液应在配置后一周内使用。
３、酶活性测试时样液酶活浓度和催化比色的吸光度并不完全线性相关，因此必须到标准所规定的浓度范围内进行测试。在该标准中，即为所未定的ΔA值范围内，因此可能需要反复测试。
４、温度对测试结果影响较大，所以测试前所用的试剂需要在标准规定的温度下平衡30分钟。
