| GB4789.4-2010 | GB4789.4-2016 |
| 前言 | 前言 |
| 本标准代替GB/T 4789.4-2008《食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验》。 本标准与GB/T 4789.4-2008 相比，主要变化如下： ——修改了标准的中英文名称； ——修改了标准的范围； ——修改了培养基和试剂； ——修改了设备和材料； ——修改了附录A。 本标准的附录A、附录B 为规范性附录。 本标准所代替的历次版本发布情况为： ——GB 4789.4-84、GB 4789.4-1994、GB/T 4789.4-2003、GB/T 4789.4-2008。 |
本标准代替GB4789.4—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、SN0170—1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》、SN/T2552.5—2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第5部分:沙门氏菌检验》。 整合后的标准与GB4789.4—2010相比,主要变化如下: ———修改了检测流程和血清学检测操作程序;———修改了附录A 和附录B。 |
| 2 设备和材料 | 2 设备和材料 |
| 2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。 2.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。 2.3 均质器。 2.4 振荡器。 2.5 电子天平：感量0.1 g。 2.6 无菌锥形瓶:容量500 mL，250 mL。 2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.8 无菌培养皿：直径90 mm。 2.9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。 2.10 无菌毛细管。 2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 2.12 全自动微生物生化鉴定系统。 |
2.1 冰箱:2℃~5℃。 2.2 恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。 2.3 均质器。 2.4 振荡器。 2.5 电子天平:感量0.1g。 2.6 无菌锥形瓶:容量500mL,250mL。 2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。 2.8 无菌培养皿:直径60mm,90mm。 2.9 无菌试管:3mm×50mm、10mm×75mm。 2.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 2.11 全自动微生物生化鉴定系统。 2.12 无菌毛细管。 |
| 3 培养基和试剂 | 3 培养基和试剂 |
| 3.17 沙门氏菌O 和H 诊断血清。 | 3.17 沙门氏菌O、H 和Vi诊断血清。 |
| 4 检验程序 | 4 检验程序 |
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| 5 操作步骤 | 5 操作步骤 |
| 5.1 前增菌 | 5.1 预增菌 |
| 称取25 g（mL）样品放入盛有225 mL BPW 的无菌均质杯中，以8 000 r/min～10 000 r/min 均质1 min～2 min，或置于盛有225 mL BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1 mol/mL 无菌NaOH 或HCl 调pH 至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 ℃±1 ℃培养8 h～18h。 如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2 ℃～5 ℃不超过18 h 解冻。 |
无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW 的无菌均质杯或合适容器内,以8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH,用1mol/mL 无菌NaOH 或HCl调pH 至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容器内(如均质杯本身具有无孔盖,可不转移样品),如使用均质袋,可直接进行培养,于36℃±1℃培养8h~18h。 如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。 |
| 5.3 分离 | 5.3 分离 |
| 分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS 琼脂平板和一个XLD 琼脂平板（或HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36 ℃±1 ℃分别培养18 h～24 h （XLD 琼脂平板、HE 琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或40 h～48 h （BS 琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表1。 |
分别用直径3mm的接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。 |
| 5.5 血清学鉴定 | 5.5 血清学鉴定 |
| 5.5.1 抗原的准备 一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如2％～3％） 培养基上再检查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了O 凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1 次～2次，自远端取菌培养后再检查。 |
5.5.1 检查培养物有无自凝性 一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应,在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水滴内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻摇动30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自凝性,反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。 |
| 5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定 在玻片上划出2 个约1 cm×2 cm 的区域，挑取1 环待测菌，各放1/2 环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对 着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 |
5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定 在玻片上划出2个约1cm×2cm 的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部, 在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O 血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如2%~3%)培养基上再检查;;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O 凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。 |
| 5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定 同5.5.2。 |
5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定 操作同5.5.2。H 抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,待菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过接种装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次~2次,自远端取菌培养后再检查。 |
| 5.5.4.1 O 抗原的鉴定 用A～F 多价O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。被A～F 多价O 血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2 和O11 因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、O10 血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19 单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。 |
5.6.1 O 抗原的鉴定 用A~F多价O 血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株,不能分型。被A~F多价O 血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集试验。 根据试验结果,判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验,判定E1、E4各亚群,每一个O 抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果,没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。 |
| 5.5.4.2 H 抗原的鉴定 小倒管法：将两端开口的小玻管 （下端开口要留一个缺口，不要平齐） 放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50 ℃，挑取因子血清1 环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1％软琼脂斜面，于37 ℃培养后再做凝集试验。 |
5.6.2 H 抗原的鉴定 小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50℃,挑取因子血清1环,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,待凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,于36℃培养后再做凝集试验。 |
| 附录A （规范性附录） 培养基和试剂 |
附 录 A 培养基和试剂 |
| A.1 缓冲蛋白胨水（BPW） A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠（含12 个结晶水） 9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.2±0.2 A.1.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121 ℃，15min。 |
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW) A.1.1 成分 蛋白胨 10.0g 氯化钠5.0g 磷酸氢二钠(含12个结晶水) 9.0g 磷酸二氢钾1.5g 蒸馏水1000mL A.1.2 制法 将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH 至7.2±0.2,高压灭菌121℃,15min。 |
| A1~A15中所有关于PH的描述都是如上改动，不在这里展开 | |
| 附录B （规范性附录） 常见沙门氏菌抗原 |
附 录 B 常见沙门氏菌抗原 |
| B.1 常见沙门氏菌抗原 | 无 |
| 无 | 注:关于表内符号的说明: {}={}内O 因子具有排他性。在血清型中{}内的因子不能与其他{}内的因子同时存在,例如在O∶3,10群 中当菌株产生O∶15或O∶15,34因子时它替代了O∶10因子。 []= O(无下划线)或H 因子的存在或不存在与噬菌体转化无关,例如O∶4群中的[5]因子。H 因子在[] 内时表示在野生菌株中罕见,例如极大多数S.ParatyphiA具有一个位相(a),罕有第2相(1,5)菌株。因此, 用1,2,12∶a∶[1,5]表示。 _=下划线时表示该O 因子是由噬菌体溶原化产生的。 |
GB 4789.4 2016版与2010版变化对比
