枯草芽孢杆菌是工业生产中重要的食品级益生菌，在发酵食品方面具有悠久历史。人工诱变筛选出的优良枯草芽孢杆菌可以在加工贮藏中更好地耐受不良环境影响仍保持高活性，而且其发酵产酶水平高，因此诱变筛选优良菌株已然成为研究热点。
经脉冲强光处理过的菌体核酸结构受到影响，而细胞中的DNA修复机制不发生作用，因此该方法可以诱导微生物发生变异。来自沈阳农业大学食品学院的赵天惠和张佰清利用脉冲强光诱变筛选出具有良好耐高温、耐强酸、耐胆盐性的枯草芽孢杆菌株B3和B7，其产酶能力也高于原始菌株，该优良性状能够稳定遗传，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析得出诱变前后菌体蛋白表达出现差异，证明了脉冲强光对枯草芽孢杆菌的诱变具有可行性，为工业微生物诱变育种开辟了新的途径，对促进酶制剂工业的发展具有现实意义。
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诱变参数的确定结果
菌株的致死率随脉冲次数增加而增大。当脉冲21 次时，致死率为76.4%；当脉冲40 次时，致死率达到92.5%；当脉冲次数大于47 次时，菌株几乎全部死亡。因此，选取菌株致死率高于90%并保证有一定数量存活菌株的诱变参数，此时菌株具有抗性，最容易发生变异，即选择脉冲电压2 450 V，照射距离5 cm，脉冲40 次，诱变效果良好。
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抗性筛选结果
根据上述诱变参数处理菌株，选取存活菌种进行斜面培养基试管培养，反复处理至第5代，该菌株第1代到第5代的致死率均在90%以上，差异不显着（P＞0.05），表现出一定的抗性。因此，从第5代存活的菌种进行筛选，得到编号分别为B1～B8的8 株菌株，并接种到斜面培养基试管中冷藏保存备用。
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初筛结果
3.1 高温耐受性菌株筛选
抗性菌株B1、B3、B4、B5、B7、B8的存活率均高于原始菌株B0，大部分均在80%以上；B2、B6的高温能力较差，当温度达到90 ℃时，菌株存活率未达到80%，与原始菌株B0差异不显着（P＞0.05）。因此，从8 株抗性菌株中筛选出B1、B3、B4、B5、B7、B8六株耐高温性的菌株进行下一步实验。
3.2 强酸耐受性菌株筛选
抗性菌株B1、B3、B4和B7在3 个pH值梯度的人工胃液中的存活率均高于原始菌株B0，都高于60%；B5、B8在pH 2环境中存活率低于60%，且B8存活率显着低于B0（P＜0.05）。因此，筛选得到B1、B3、B4和B7这4 株菌株继续实验。
3.3 胆盐耐受性菌株的筛选
抗性菌株B3、B4和B7在不同胆盐质量浓度中的存活率均高于原始菌株B0，且都不低于70%；菌株B1在胆盐质量浓度为0.1 g/100 mL和0.2 g/100 mL时存活率较高，当质量浓度达到0.3 g/100 mL时，其耐受性较差，存活率不足70%，显着低于原始菌株B0（P＜0.05）。因此，只有B3、B4和B7三株菌株符合耐胆盐性的标准。
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复筛结果
与原始菌株相比，经脉冲强光诱变的菌株产α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶3 种酶周围形成透明水解圈直径与菌落直径的比值（A/a值、P/p值和Z/z值）更大，菌株B4的比值（A/a值、P/p值和Z/z值）比原始菌株增加量小于10%，只有菌株B3和B7的比值增加量远超过10%，差异显着（P＜0.05），因此筛选出发生正突变的菌株B3和B7，其产酶能力有较大提高。
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酶活测定及产酶遗传稳定性分析
α-淀粉酶活测定及菌株产酶稳定性分析
1
变异菌株B3和B7的α-淀粉酶活分别为（114.06±0.43）U/mL和（120.89±0.32）U/mL，是原始菌株B0酶活（68.3±0.14）U/mL的1.67 倍和1.77 倍，差异极显着（P＜0.01）。将变异菌株B3、B7分别传代培养5 次，酶活变化幅度很小，差异不显着（P＞0.05），说明变异菌株产酶能力稳定。
L-酪氨酸标准曲线
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根据标准曲线的线性回归方程y=0.010x＋0.002 5，R2= 0 . 9 9 8 8 ，说明此方法在L - 酪氨酸质量浓度为0～100 μg/mL时具有良好的线性关系。
蛋白酶活测定及菌株产酶稳定性分析
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变异菌株B3和B7的蛋白酶活分别为（88.3±0.35）U/mL和（96.79±0.26）U/mL，比原始菌株B0酶活（56.6±0.21）U/mL提高了56%和71%，差异极显着（P＜0.01），经传代培养5 次，B3和B7的酶活力趋于稳定，差异不显着（P＞0.05），因此，脉冲强光诱变处理得到的变异菌株产蛋白酶能力可良好稳定遗传。
原始和变异菌株的SDS-PAGE分析
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原始菌株和变异菌株蛋白条带存在有无和明暗的差异。3 株菌株在分子质量大小约为28 kDa处均出现清晰的条带，但变异菌株B7、B3的条带比原始菌株B0颜色更深更明显；B7、B3比B0多出一条分子质量大小约为16 kDa的条带；B7在分子质量约为19 kDa的条带比B3更宽一些，B7蛋白表达更多；B3、B7在分子质量大小约为21、36 kDa处均出现条带，在相同两处B0却没有条带，说明原始菌株经诱变处理，促进了某些蛋白质的合成；3 株菌株在分子质量大小为58～62 kDa之间出现明显的条带，B7、B3的蛋白表达量更高。
结 论
在脉冲电压2450 V，照射距离5 cm，脉冲40 次条件下，筛选出8 株抗性菌株；经初筛和复筛得到兼具高温耐受、强酸耐受和高浓度胆盐耐受性变异菌株B3和B7，产α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力分别比原始菌株提高了67%和77%（P＜0.01）、56%和71%（P＜0.01）、34%和42%（P＜0.05），变异菌株产酶稳定性较高（P＞0.05），可遗传变异；诱变前后菌体蛋白表达出现差异；结果证明脉冲强光用于枯草芽孢杆菌的诱变具有可行性。
