摘 要
本文利用T7病毒包装马达纳米孔道在单分子水平上检测不同多肽。混合物中具有一个氨基酸差异的不同多肽可被T7纳米通道鉴别。T7纳米孔道可以在线区分胰蛋白酶分解前后的多肽，这个实验表明T7也可以作为血清异常蛋白酶的诊断工具。
正 文
总结简要
蛋白质鉴定，检测和测序对研究蛋白质的生物功能和相关疾病检测和诊断具有重要作用。传统的蛋白质鉴定有多重局限性，例如：蛋白质测序主要依赖于质谱，但目前质谱检测的方法还没法区分化学成分（M/Z）相同但三维结构不同的蛋白质。近年来，纳米孔技术被广泛应用于生物大分子的检测，如核酸DNA、RNA等。但是由于氨基酸种类有二十来种，形状、电荷和结构的多样性使到应用纳米孔技术进行多肽或蛋白测序带来困难。在本文中，T7噬菌体DNA 包装马达纳米孔通道被嵌入到磷脂双层膜中，形成生物纳米孔道。不同长度的多肽通过T7纳米孔道时，产生了电流阻碍强度的差异和穿孔时间的区别。根据不同多肽产生的不同电信号，只要这些多肽中存在一个氨基酸长度的差异， T7 纳米孔就可以清楚地将他们鉴别区分。基于这项研究，T7纳米孔道可以清楚地检测胰蛋白酶的存在。胰蛋白酶分解后的小肽可作为诊断指标实现在线检测，表明了T7纳米通道可以作为与体内疾病相关的异常蛋白酶的检测工具。
全文翻译
用病毒马达纳米孔道以单个氨基酸差异的水平鉴别多肽
Zhouxiang Ji(季州翔), Xinqi Kang（康鑫琦）, Shaoying Wang#（王少英）, Peixuan Guo（郭培宣）*
Center for RNA Nanobiotechnology and Nanomedicine; Division of Pharmaceutics and Pharmaceutical Chemistry, College of Pharmacy; College of Medicine, Dorothy M. Davis Heart and Lung Research Institute and James Comprehensive Cancer Center; The Ohio State University (俄亥俄州立大学), Columbus, Ohio, USA.
#Current address: P&Z Biological Technology, Newark, NJ, USA
摘 要:
蛋白质组学的检测、区分、作图和测序在蛋白质组学中是重要的，用于评估细胞发育，例如蛋白质甲基化或磷酸化以及疾病的诊断，包括代谢紊乱、精神疾病、免疫疾病和恶性癌症。纳米孔技术已经证明了DNA、RNA、化学品或其他大分子的测序或检测的潜力。由于蛋白质在形状、结构和电荷方面的多样性以及20种氨基酸的组成多样性，蛋白质的测序仍然具有挑战性。在此，我们报道了噬菌体T7 DNA包装马达通道的应用，用于区分仅有单一氨基酸差异的各种肽。基于单个肽当前阻断和停留时间获得明确的指纹或签名。蛋白酶消化后小蛋白质的清晰映射的数据表明使用T7纳米通道进行蛋白质组学（包括蛋白质测序）的潜力。
介 绍:
蛋白质组学是一个具有挑战性但非常重要的领域，对于理解某些蛋白质在各种遗传疾病、免疫畸变、代谢紊乱和癌症疾病发病中的生物学功能和作用至关重要[1-3]。在目前阶段，多肽或蛋白质的指纹识别主要依赖于质谱（MS），然而质谱目前尚未达到单分子的灵敏度[4,5]。为了推进蛋白质组学领域，纳米孔技术为单分子水平的肽指纹提供了另一种方法。纳米孔检测的原理基于电阻脉冲技术，即，通过电力驱动分析物通过孔，以产生表征所关注的每种分析物的皮安安氏级电流特征的分布[6-8]。
目前，纳米孔技术主要侧重于核酸表征[9-13]。一些研究显示肽或蛋白质传感的巨大潜力[14-18]。例如，蛋白质大小，波动和构象变化已经通过固态纳米孔研究[19-22]。在一项特定研究中，α-溶血素用于肽裂解的实时监测[23,24]。利用其他门户进行蛋白质折叠的其他研究[25,26]，用于区分肽的Phi29连接器[27]和用于肽寡聚化的SPP1连接器[28,29]也进行了其他研究。
生物马达在生命系统中非常普遍，促进了各种功能[30-36]。在dsDNA动物或细菌病毒如Phi29、SPP1、T3、T4、T5和T7中，它们的基因组分别在复制和感染期间通过称为连接子的门静脉蛋白通道进入和离开噬菌体衣壳[37-43]。噬菌体T7属于Podoviridae家族，可以感染大肠杆菌（E.coli）。来自低温电子显微镜的数据显示，T7连接器由基因8（gp8）编码的12个亚基组成，分子量为59kDa [44,45]。在该研究中，克隆了T7连接基因并在大肠杆菌中表达。将纯化的T7连接器插入脂质双层膜中作为生物传感器用于不同肽的指纹分析。然后将它们的阻断或停留时间用作每种肽的明确特征。在用蛋白酶消化后实现了几种肽的清晰映射，表明使用T7纳米孔技术进行蛋白质组学和蛋白质测序的潜力。
结果与讨论
克隆并在大肠杆菌中表达T7连接器并将纯化的连接器插入脂质双层膜中。
编码噬菌体T7 DNA包装马达的连接蛋白的基因gp8通过六-Aa His-标签融合到C-末端克隆到质粒pET-3c中，促进蛋白质纯化[46,52] 。在IPTG诱导后，过表达的gp8基因自发地组装成其通道复合物（图1a，b）。基于12％SDS-PAGE结果将连接器纯化成均一大小的蛋白（图1c）。与其他膜蛋白不同，如果不介导囊泡脂质体或卟啉，病毒运动通道不能插入脂质双层膜[10,53]。为此，将纯化的T7连接器掺入脂质体中以形成蛋白脂质体，然后按照如先前报道的那样通过融合将其插入脂质双层膜中[10,48]。单通道表征（图1d）显示T7连接器的电导为0.73±0.10 nS，基于50 mV下117个通道的测量（图1e）。 T7连接基因的克隆和表达以及随后在脂质双层膜中的连接器插入产生组装的纳米孔，其最终将用于肽的表征和作图。
通过电流阻断来区分不同残基的肽
考虑到纳米孔感应的原理，我们首先研究了由8个（R8;图2a，b，c），9（R9;图2d，e，f），10（R10;图2g，h）组成的五种不同长度的精氨酸肽。，i），11（R11;图2j，k，l）和12（R12;图2m，n，o）残基，带正电荷。阻断和停留时间用于表征肽。使用等式（Io-Ib）/ Io×100％计算阻塞百分比，其中Io是不存在肽穿孔（开放通道电流）时的通道电流，Ib是肽穿孔期间的电流（阻断电流）。目前，我们只专注于基于阻断的肽的分化，其通过高斯分布拟合。 R8，R9，R10，R11，R12的阻断分别为44.58％±1.74％，50.70％±0.93％，54.61％±0.81％，57.77％±1.20％，60.55％±0.77％（图2b，e， h，k，n）。每种肽的每个阻断峰具有相对良好的分离，至少约3％。肽通过通道产生的电信号与通道窄区的长度有关。不出所料，较长的肽具有较大的阻塞百分比和较长的停留时间。这表明具有12个氨基酸的肽的长度短于T7连接器的窄区域的长度，并且每个氨基酸对阻塞和停留时间有贡献作用。通过电力驱动，肽可以通过T7连接器。在这个过程中，质量，电荷和大小的氨基酸差异原则上可能影响电流阻塞和停留时间。
鉴别混合物中不同大小的肽
研究表明T7纳米通道在生物样品混合物中分化肽的潜力。如图2所示，每种肽的阻断峰显示出足够的分离。将R8，R9，R10和R12肽保持在恒定浓度（21nM）下进行纳米孔穿孔实验（图3）。从图3a，b，由于通过高斯分布拟合数据，存在四个不同的阻塞峰，分别为45.20％±1.55％，50.80％±0.96％，54.65％±0.75和59.89％±0.64％。这些峰与单独测量的各个肽的阻断参数相匹配。尽管目前的阻断峰已被广泛用作各种分析物的可靠且灵敏的特征，但据报道，停留时间参数是异质的，具有较大的变化[54-56]。令人惊讶的是，当R8，R9，R10和R12肽存在于混合物中时，以离散顺序获得清晰且不同的停留时间特征（图3c）。
在线监测胰蛋白酶消化11-aa和12-aa多肽
为了评估T7通道对蛋白质作图的潜力，用胰蛋白酶消化了两种肽。将R11或R12肽（63nM）与缓冲液在室中预混合，并在单通道插入后记录易位信号。随后，将胰蛋白酶加入顺式腔室中并混合，同时连续记录穿孔事件。如图4a，b，c所示，R12的阻塞率为60.57％±0.45％。加入胰蛋白酶后，出现3个新峰，分别为45.29％±0.82％，51.23％±0.54％和54.91％±0.48％;这些结果表明肽R12被切割成多个片段，R8，R9和R10（图4d，e，f）。然而，T7连接器检测不到由少于8个氨基酸组成的肽。
胰蛋白酶被认为是内肽酶，这意味着它不会消化C-末端的精氨酸。通过蛋白酶消化对R12的定位未显示对应于R11的阻断峰（图4e）。为了确认R11的遗漏峰不是由于R11和R12之间的阻断峰重叠的问题，R11裂解是平行进行的。在向室中加入胰蛋白酶之前，单个阻断峰值为57.68％±1.22％，代表R11（图4g，h，i）;然而，随着胰蛋白酶添加到顺式腔室，对应于R11的易位事件随时间减少，而两个新的峰值分别为45.06％±1.38％和51.59％±2.27％（图4j，k，l） ）。这两个峰与图2中代表R8和R9的两个峰匹配。在胰蛋白酶的R11消化中没有R10阻断峰。 R11和R12的肽作图支持胰蛋白酶是内肽酶的概念，并且C末端的至少两个氨基酸是切割所必需的。
多种蛋白酶测定来诊断不同的疾病已经被广泛使用[57-59]。例如，胰蛋白酶已被用作诊断胰腺炎的最可靠标记物。因此，此处报道的肽作图方法也可用于监测血清酶活性或利用蛋白酶作为标记物诊断各种疾病。该研究的结果表明，除蛋白质测序外，纳米孔技术还具有疾病诊断的潜力。
结 论
重新设计的T7连接器用作单孔传感仪器，以区分具有一个氨基酸残基差异的肽。 通过使用纳米孔清楚地区分四种肽的当前变化和停留时间的个体特征。胰蛋白酶消化后基于小肽指纹的蛋白质定位揭示了在疾病诊断中检测血清蛋白酶异常的潜力。 为了促进蛋白质组学领域的发展，我们的研究结果为使用纳米孔技术进行蛋白质定位和测序奠定了基础，并展示了蛋白质孔在生物医学应用中的额外潜力。
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基金资助：
本研究由NIH R01EB012135资助。
课题组介绍：
Dr. Peixuan Guo 郭培宣
本研究工作由郭培宣教授领导的科研团队完成，课题以季州翔为主体。郭培宣教授1987年于美国明尼苏达大学取得博士毕业，现任Ohio State University (俄亥俄州立大学) Sylvan G. FrankEndowed Chair(纳米生物技术首席讲座教授)，是国际RNA纳米技术奠基和发明人，国际RAN 纳米技术和纳米医学协会主席，俄亥俄州立大学RNA纳米生物技术和纳米医学中心主任。新近担任五届RNA纳米技术国际会议主席，并任2015年RNA纳米技术GRC（戈登会议）的主席和创始人。在2006年到2011年间他担任美国NIH其中的一个国家纳米医药发展中心主任，十年来连续担任美国三所着名大学首席讲座教授(Endowed Chair)。他现有眼成员23人，包括1名进修教授，1名副教授，2名资深科学家，2名博士后，1位管理工作人员，其余为博士研究生。目前实验室主要研究方向包括RNA纳米技术及肿瘤靶向给药，生物马达及病毒DNA包装机制，单分子纳米孔测序和外泌体平台等。
简 历：
郭教授首建了phi29 DNA包装马达(PNAS, 1986)，发现了phi29马达pRNA (Science, 1987)，体外装配了有繁殖力的双链DNA病毒(J Virology, 1995)，发现了pRNA六聚体(Mol Cell, 1998)。2013年他发现第三种公转而不自转生物马达。该发现解决了科学界37年来关于病毒 DNA 包装马达机制的争端。郭教授本人是RNA纳米技术的创始人（Mol Cell, 1998; JNN, 2003; Nano Lett, 2004, 2005; Nat Nanotech, 2010， 2011，2018），并开发和创造了利用RNA纳米颗粒作为新的治疗癌症及病毒感染的靶向药物传递系统。他的课题组发现了一个具有超级热力学稳定性的pRNA-3WJ结构（Nat Nanotech, 2011; Nano Today,2012)，能特异性靶向结合到癌细胞，而没有蓄积在正常组织和脏器。他的课题组近期还解出了pRNA-3WJ基序的晶体结构（RNA, 2013);构筑了双成像系统来检测单个荧光素（EMBO J, 2007;RNA, 2007），并把phi29马达通道嵌合到质膜上以开发单分子通道的双链DNA高通量测序（Nat Nanotech, 2009）。郭教授是5个纳米技术杂志的编辑或董事，他的工作在电台或电视如ABC或NBC上被报道过数百次，并在时事通讯或NIH、NSF、MSNBC、NCI和ScienceNow的网站上占据重要位置。他是NIST、NIH、NSF和纳米技术全国委员会的两个重要国家纳米技术委员会的成员，并且在2006至2010年任NIH纳米医药发展中心指导委员会成员；美国国立卫生研究院（NIH）2010年和2014年内部科研审查委员会成员(NIH Intramural Research Site-Visit Review Panel)。
实验室网站：
http://rnanano.osu.edu/Guo/peixuanguo.html
注:
本文原稿于03月07日提交到Nature Nanotechnology，随后于06月11日改提交到Biomaterials。Biomaterials是Elsevier旗下的国际期刊，最新影响因子8.806，论文涵盖生物材料的基础科学和临床应用。
原文信息：
Ji, Z., Kang, X., Wang, S., & Guo, P.(2018). Nano-channel of viral DNA packaging motor as single pore to differentiatepeptides with single amino acid difference. Biomaterials, 182, 227-233.
本文链接如下：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nano-channel+of+viral+DNA+packaging+motor+as+single+pore+to+differentiate+peptides+with+single+amino+acid+difference
