基质固相分散前处理是近年来一种新的固相提取技术，可以将提取净化集于一体，已经被广泛应用于基质复杂样品的前处理，可以有效避免HPLC-MS/MS由于基体效应造成的信号影响。云南中烟工业有限责任公司技术中心的李 晶、倪朝敏、陈建华等人基于基质固相分散处理的原理，设计开发出一种新型的在线净化前处理装置，用于基质复杂的香精香料的前处理净化，方法操作简单，净化萃取浓缩为一体，经过提取净化后的样品利用HPLC-MS/MS进行测定，可以应用于香精香料中麦角甾醇和麦角甾酮的监控分析。
1、样品前处理条件
样品前处理装置
装置由普通索式提取装置改装而来（球形烧瓶500 mL，抽出筒直径40 mm，抽出筒长190 mm），对抽出筒下端进行改装，加入了1 个三通阀进行溶剂的冷凝或者回收。样品利用硅胶进行基质分散，装填好筛板、硅胶层、样品硅胶层和无水硫酸钠层，将三通阀调整到提取管与圆底烧瓶相通的状态，启动水浴锅加热，溶剂蒸发后再经冷凝管回流冷凝到填料管中；溶剂把样品中的麦角甾醇和麦角甾酮洗脱下来，通过硅胶层进行净化，部分极性杂质被净化；回流后的样品溶液经无水硫酸钠层干燥，以便于溶剂回流和冷凝，经过一段时间的回流提取，样品中的麦角甾醇和麦角甾酮被完全提取并转移到圆底烧瓶内；然后转换三通阀，让溶剂从溶剂回收出口流出，这样圆底烧瓶中的溶液不断被浓缩，当溶剂浓缩到干后，换成反相色谱分析常用溶剂乙腈进行残余样品的溶解，即可供液相色谱分析用。
前处理溶剂选择
结果表明石油醚、环己烷、正己烷溶剂洗脱强度较弱，麦角甾醇和麦角甾酮不能被完全洗脱，回收率低于50%；二氯甲烷和三氯甲烷具有较强的洗脱能力，麦角甾醇和麦角甾酮回收率均在90%以上；实验发现，如果换成极性更大的乙酸乙酯或丙酮作为洗脱溶剂，麦角甾醇和麦角甾酮也能被完全洗脱，但由于洗脱下来的杂质成分也相应增加，样品浓缩时容易出现沉淀或变浑浊，影响样品的净化效果。考虑到二氯甲烷毒性比三氯甲烷低，而且沸点低，容易实现回流，因此，本实验中选择二氯甲烷作为前处理中的溶剂。
前处理溶剂体积优化
当提取装置中的溶剂量达40 mL时能保持正常回流循环，溶剂加入量在50～80 mL之间待测组分的回收率均稳定，均在90%以上，继续增加溶剂量对待测组分的回收率没有影响，但会导致样品前处理的溶剂消耗增加。考虑到在样品前处理过程中溶剂因蒸发而有少量损失，因此选择在提取器中加入60 mL的二氯甲烷溶剂。
前处理温度优化
当水浴温度超过45 ℃时，尾管烧瓶中的溶剂开始沸腾，随温度升高，溶剂蒸发速度迅速加快，当温度达到55～65 ℃时溶剂蒸发速率能达到5 mL/min左右（稍大于提取管内柱层析上的流下速度）。如果温度低于55 ℃，溶剂蒸发慢，需延长样品处理时间。因此，实验优化选择水浴温度为60 ℃。
前处理提取时间优化
选取经硅胶基质分散的样品，在60 ℃的水浴中进行回流提取，考察提取时间对麦角甾醇和麦角甾酮测定结果的影响。比较了提取时间分别为20、25、30、35、40、45、50、60 min的测定结果。结果表明：提取时间在40 min以后麦角甾醇和麦角甾酮萃取效率达到一个稳定值，测定结果趋于稳定，进一步延长提取时间则会导致更多的杂质洗脱下来而影响样品的净化效果；为节约时间并避免引入更多的干扰成分，本实验选择45 min作为样品提取的最佳时间。
2、HPLC-MS/MS分析条件优化
由于在大气压化学电离模式下，乙酸铵、乙酸等电喷雾要求较低的挥发性缓冲盐会抑制麦角甾醇等甾体类化合物的有效电离，使其响应信号降低，故优选甲醇-水体系作为流动相，选择5 μL进样量，色谱柱温度为40 ℃。
3、方法评价
方法线性关系、检出限和定量限结果
目标检测物质在1.5～250 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数大于0.999，麦角甾醇定量限为0.98 μg/mL，麦角甾酮定量限为1.16 μg/mL。
重复性考察结果
麦角甾醇的相对标准偏差在3.1%～3.6%之间，麦角甾酮的相对标准偏差在3.3%～3.5%之间，方法的日间精密度较好。
方法的回收率结果
选取了5 种不同类型的模拟霉变香精香料，分别进行了高（20 μg）、中（10 μg）、低（5 μg）3 个水平的加标回收率实验，麦角甾醇的回收率在91%～96%之间，麦角甾酮的回收率在86%～93%之间，方法回收率较为理想，可以应用于实际样品的分析测定。
4、实际样品分析
结果表明，除5 种人工模拟加速霉变的样品外，其他企业在用的香精香料样品中麦角甾醇和麦角甾酮含量均低于检测限，说明企业在用香精香料中暂时没有发现霉变风险，而本方法可以有效监控和检测到香精香料样品的霉变情况。
结 论
本实验以麦角甾醇和麦角甾酮为霉变标志物，建立了一种新型在线净化前处理HPLC-MS/MS测定香精香料中的麦角甾醇和麦角甾酮的方法，用于香精香料样品霉变情况监控的筛查。方法结合基质分散萃取，柱层析以及索式提取创新性的开发设计了一个在线净化前处理装置，集萃取、净化和浓缩为一体，具有前处理简便易操作，稳定性强，溶剂可回收等优点，方法优化了液相色谱和质谱的各个参数，采用内标法可以快速、有效地对香精香料中的麦角甾醇和麦角甾酮进行测定，该方法已经应用于实际样品的测定，可以对香精香料的安全风险进行有效防控，具有重要应用价值和现实意义。
