鉴于此，浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室的顾春涛、毕伟伟和朱军莉*以牛肉为研究对象，采用依赖培养的16S rDNA测序结合非培养的高通量测序分析牛肉在0 ℃贮藏的微生物菌群变化，鉴定冷鲜牛肉中的优势腐败菌，评价其致腐性。研究为较全面了解冷鲜牛肉中微生物动态变化，分析主要特定腐败菌，以期为靶向抑制腐败菌生长，为高品质牛肉冷鲜技术的研发提供参考。
01
冷鲜牛肉感官评分腐败菌总数变化
结果显示，牛肉在冷藏前9 d感官品质保持较好，第12天肉品新鲜度下降，第15天出现异味，第18天样品有酸败味，感官品质不可接受。牛肉在0 ℃贮藏初期微生物缓慢增加，第3天增长快速，至第9天超过6（lg（CFU/g）），而第15天达到8.73（lg（CFU/g）），之后达到稳定。牛肉在冷藏中CFC琼脂上假单胞菌数、STAA琼脂上热死环丝菌数、VRBA琼脂上肠杆菌数和MRS琼脂上乳酸菌数不断上升，其增长趋势与菌落总数相似，其中假单胞菌数和热死环丝菌数增长最快，肠杆菌数和乳酸菌数的增长较慢。牛肉贮藏末期假单胞菌数最高，热死环丝菌次之，而肠杆菌数和乳酸菌数低于假单胞菌约2（lg（CFU/g））（P＜0.05）。结合感官评价和菌落总数，0 ℃冷藏牛肉的货架期约为15 d。
02
冷鲜牛肉菌相的16S rDNA鉴定
从新鲜牛肉和腐败牛肉样品分别挑选具有特异性形态的菌落13 株和15 株，经纯化及初步鉴定后发现新鲜肉和腐败肉分别有9 株和11 株为革兰氏阴性菌，表明牛肉中腐败微生物菌群主要以革兰氏阴性菌为主。将28 株菌以16S rDNA 通用引物PCR扩增，测序后得到的序列采用GenBank数据库中的BLAST进行同源性比对，所显示结果如图2。培养及生理生化特征结果显示好氧革兰阴性菌假单胞菌和阳性菌热死环丝菌是冷鲜牛肉有氧贮藏下的优势腐败菌。
03
冷鲜牛肉微生物高通量检测分析
结果发现，104 个属的细菌和部分未分类的细菌被挖掘，其中新鲜牛肉中有89 种，腐败牛肉中有43 种，其中两个样品中共有OTU数为27。培养依赖16S rDNA结合不依赖培养高通量测序分析菌群种类基本相似，冷鲜牛肉初始菌相复杂，主要由热死环丝菌、嗜冷菌、假单胞菌、不动杆菌、气单胞菌等多种微生物构成。随着冷藏期的延长牛肉中腐败菌相趋于简单，其中假单胞菌和热死环丝菌为优势腐败菌，占主导地位。腐败牛肉中假单胞菌是优势腐败菌，莓实假单胞菌是冷鲜牛肉的优势腐败菌。
04
优势腐败菌在牛肉汁中致腐性评价
细菌生长
牛肉汁空白组在贮藏期内无细菌生长。在货架期前期（6 d），接种热死环丝菌组、假单胞菌组和蜂房哈夫尼菌组分别达到7.23～7.33、6.80～7.10（lg（CFU/mL））和6.81（lg（CFU/mL））。在货架期末期（15 d），接种牛肉汁的菌液浓度热死环丝菌组达到8.43～8.50（lg（CFU/mL）），假单胞菌组为7.58～7.95（lg（CFU/mL）），而蜂房哈夫尼菌的菌液浓度达到8.46（lg（CFU/mL））。在3 种优势腐败菌中热死环丝菌和哈夫尼细菌菌液浓度较高，假单胞菌菌液浓度较低。
感官评定
牛肉汁空白组感官评价良好。而接菌组感官品质均呈下降趋势，较空白组感官变化明显。冷藏6 d接种热死环丝菌组、假单胞菌组和蜂房哈夫尼菌组的感官评分分别达到1.33～2.17、2.67～6.33和4.00。15 d接种牛肉汁的感官评分热死环丝菌组达到3.17～4.50；假单胞菌组为6.00～8.33，不可接受；而蜂房哈夫尼菌的感官评分达到8.33，也不可接受。在3 种优势腐败菌中假单胞菌和哈夫尼细菌感官变化较快，其中莓实假单胞菌PS28最高，其次为PS30、PS26和PS27。
蛋白酶活性
热死环丝菌、假单胞菌和蜂房哈夫尼菌优势腐败菌蛋白酶活性在第6天变化较小，仅发现假单胞菌PS26、PS20、PS16、PS27、PS28、PS29和PS30表现蛋白酶活性（P＜0.05），除PS30外在冷藏至第15天显着增加（P＜0.05），分别达到32.13、5.66、3.00、10.77、10.62、1.40 U/mL，其中莓实假单胞菌PS26最高，其次为PS27和PS28。假单胞菌的蛋白酶活性具有菌株依赖，而热死环丝菌和蜂房哈夫尼菌未有蛋白酶活性。
pH值
牛肉汁空白组初期pH值为6.10，冷藏15 d无变化（P＞0.05）。热死环丝菌组冷藏6 d pH值下降至5.09～5.41（P＜0.05），假单胞菌组pH值上升至6.08～6.85（P＜0.05），蜂房哈夫尼菌组pH值达到6.23。贮藏至第15天，热死环丝菌组中除BT7下降外其余无明显降低（P＞0.05），假单胞菌组中PS16、PS17、PS19、PS26、PS27菌pH值显着上升（P＜0.05），增至6.28～6.82，其余组无显着变化（P＞0.05）；接种蜂房哈夫尼菌牛肉汁pH值为6.27。研究发现接种热死环丝菌BT7和BT10的pH值最低，而接种假单胞菌PS28的pH值最高，达到7.18。
TVB-N值
无菌牛肉汁初期TVB-N值为5.25 mg/100 mL。接种热死环丝菌组、假单胞菌组和蜂房哈夫尼菌组在冷藏至第6天时，TVB-N值分别为6.30～7.00、5.60～10.85 mg/100 mL和7.00 mg/100 mL。冷藏15 d热死环丝菌组中TVB-N值上升至8.23～8.58 mg/100 mL，假单胞菌组中除PS16和PS30外，其余接种牛肉汁TVB-N值上升至8.23～15.23 mg/100 mL（P＜0.05），其中莓实假单胞菌PS28菌株上升最快（P＜0.05）；而接种蜂房哈夫尼菌牛肉汁的TVB-N值达到8.23 mg/100 mL。
结 论
研究采用培养依赖16S rDNA鉴定结合高通量测序技术较详实地分析冷鲜牛肉冷藏中微生物群落结构的动态变化，发现冷鲜牛肉贮藏初期细菌表现多样性，而腐败终点菌群种类明显下降，以假单胞菌和热死环丝菌为优势腐败菌。腐败末期优势腐败菌表现不同的致腐性，其中假单胞菌和蜂房哈夫尼菌致腐性强于热死环丝菌，假单胞菌还表现较强的蛋白酶活性，其中莓实假单胞菌PS28致腐性最强。可见，冷鲜牛肉中的特定腐败菌是莓实假单胞菌。
