河北农业大学食品科技学院的宁亚茹、李琪和桑亚新*等人以普通市售酸乳为研究对象，通过改进以往所建立的HPLC法，对酸乳酪蛋白酶解释放的β-CM进行定性和定量分析，从细胞生物学、小鼠行为学方面对酶解液的阿片活性进行测定，以期为酸乳中β-CM的释放规律及其生理功能的研究提供有效的方法和手段，进一步挖掘酸乳中生物活性肽的营养与功能，并为具有镇痛镇静活性的功能食品开发提供数据。
01
酸乳消化程度分析
如图1示，在泳道2、3上酪蛋白位置均没有条带，但在较小的分子质量处出现条带；酸乳所在的泳道4只有单一的酪蛋白条带，这个现象表明酪蛋白并没有被酸乳发酵过程中的乳酸菌水解。在人工模拟胃肠道消化液中，酸乳中的酪蛋白被胃蛋白酶、胰蛋白酶完全水解并且产生了小分子质量活性多肽。
02
酸乳消化液的分离纯化结果
采用葡聚糖凝胶G15层析柱对酸乳消化液粗品进行分离纯化，结果显示，得到单一峰且峰形良好，响应值较高，收集各组分的洗脱液，待进一步分析。
03
酸乳及其消化液β-CM的定量分析
在酸乳的人工模拟胃肠道消化过程中，β-CM-7在胰腺中的释放量高于在胃中，在酸乳胰腺粗消化液中质量浓度达到0.407 mg/mL；而β-CM-5在胃中的释放量高于胰腺中，在VSYSD粗品中达到0.830 mg/mL。在未纯化的酸乳粗样品中存在微量的β-CM-7（0.022 mg/mL）和β-CM-5（0.021 mg/mL），但是经过复杂的纯化步骤后，酸乳中的β-CM质量浓度利用HPLC法已经不能检出。综上可知，酸乳在经过胃肠消化后β-CM释放量在胃中达到最高，但相比血管紧张素转化酶抑制肽等生物活性肽其释放量较小。
04
酸乳及其消化液β-CM阿片活性分析
NG180-5细胞的cAMP活力
NG108-15细胞是研究阿片类物质活性常用细胞模型，其富含δ-阿片受体，阿片类物质可以与其上受体结合，影响cAMP活力，阿片特异性拮抗剂纳洛酮能拮抗这种作用。
β-CM-7标准品以及酸乳的胃消化液、胰消化液均可刺激NG108-15 cAMP活力，并且它们的刺激作用均可以被纳洛酮拮抗；酸乳样品也可以影响NG108-15 cAMP活力，但是影响较小且不能被纳洛酮拮抗，由此说明酸乳本身不具有阿片活性，经过人体胃肠消化后均可以产生具有阿片活性的β-CM。
小鼠镇痛实验结果
本研究主要关注β-CM阿片活性中的镇痛以及抗疲劳作用。结果显示，与生理盐水组相比较，VSYSD和VSYPD镇痛活性均从20 min开始有显着性差异，并且在30 min时达到最好效果，从30 min后均有镇痛效果，但呈下降趋势。VSYSD和VSYPD的镇痛作用都能被纳洛酮拮抗，并且VSYSD中纳洛酮的拮抗作用比VSYPD强。纳洛酮是阿片肽的特异性拮抗剂，所以能够确定VSYSD和VSYPD中均含有阿片活性物质，且镇痛作用为阿片肽的活性。
从上图中可以看出，给药30 min后，酸乳消化液作用于小鼠，使其痛阈提高率达到最高，注射VSYSD的小鼠痛阈提高率达到59.80%；注射VSYPD的小鼠痛阈提高率达到44.37%，VSYSD的镇痛效果要高于VSYPD。
小鼠抗疲劳实验结果
本实验通过给药后小鼠负重游泳实验来测定酸乳酶解液中β-CM的抗疲劳作用。结果表明，不同酸乳消化液注射组与生理盐水组相比，均能够延长小鼠的负重游泳时间，注射高剂量纯化后的VSYSD使小鼠的平均游泳时间延长了18.94 min。粗VSYSD、纯化后VSYSD低剂量组和纯化后VSYSD高剂量组与生理盐水组相比均有显着差异，此外注射粗VSYSD+纳洛酮并没有延长小鼠的负重游泳时间，说明纳洛酮拮抗了VSYSD的作用。结果表明，VSYSD具有抗疲劳的作用，且此作用可以被阿片拮抗剂纳洛酮拮抗，因此本研究中酸乳消化液的抗疲劳作用为阿片活性作用。酸乳β-CM作为食源性生物活性肽安全性高，是极具发展前景的功能因子，在营养健康领域具有很大的研究前景。
05
结 论
本实验优化的分离纯化方法为酸乳中生物活性肽的分离提取提供了有效的手段。酸乳中存在微量β-CM-7和β-CM-5，经过体外模拟消化后β-CM-7、β-CM-5质量浓度显着上升，说明酸乳经过消化液作用后释放出了β-CM-7、β-CM-5。此外，酸乳本身不具有阿片活性，而酸乳胃、胰消化液具有良好的阿片活性，说明人类在饮用酸乳后体内产生了β-CM，且酸乳β-CM具有阿片活性，能够对人体起到镇静舒缓、抗疲劳等功效；动物实验表明VSYSD可使小鼠痛阈提高59.80%，且酸乳消化液在小鼠的体内展现了良好的活性功能。本实验为酸乳中β-CM的释放规律及其生理功能的研究提供了有效的方法和手段，并为具有镇痛、镇静活性功能食品的开发提供数据。
