东南大学公共卫生学院营养与食品卫生学系的付凌萌、吴 逸、王少康*等人用木犀草素与叶酸单独及联合干预经AFB1染毒的人正常食管上皮细胞（HEEC），检测细胞增殖、周期、凋亡及亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）蛋白表达水平及基因启动子CpG区的甲基化状态，阐明木犀草素和叶酸对AFB1的细胞毒性及表观遗传改变的影响，为二者协同降低AFB1对食管的毒性提供理论依据。
1、AFB1对HEEC活力的影响
HEEC经不同浓度的AFB1分别处理24、48 h和72 h后，细胞活力均被抑制。1～200?μmol/L范围内，细胞抑制率随着AFB1浓度的增加而升高，100、200?μmol/L AFB1处理组细胞抑制率极显着高于空白对照组（P＜0.01），AFB1可以抑制HEEC的增殖，抑制率呈剂量依赖性升高。
2、LUT及FA对AFB1染毒的HEEC的影响
LUT及FA对AFB1染毒细胞增殖的影响
AFB1＋LUT、AFB1＋LUT＋FA1及AFB1＋LUT＋FA2组细胞抑制率显着低于染毒组（P＜0.05），而单独使用FA干预（AFB1＋FA1组、AFB1＋FA2组），效果不显着（P＞0.05）。AFB1＋LUT组与AFB1＋LUT＋FA1组及AFB1＋LUT＋FA2组细胞抑制率差异无统计学意义（P＞0.05）。
LUT及FA对AFB1染毒的HEEC细胞周期的影响
结果可知，AFB1可诱导HEEC周期发生改变，G0/G1期细胞比例升高（P＜0.05），S期细胞比例降低（P＜0.05），说明AFB1将HEEC阻滞于G0/G1期，抑制细胞分裂增殖。与染毒组相比，LUT干预组、联合干预组G0/G1期细胞比例较染毒组显着降低（P＜0.05），S期的细胞所占比例显着升高（P＜0.05），减少了AFB1对细胞G0/G1期的阻滞作用。AFB1＋LUT组与AFB1＋LUT＋FA1组及AFB1＋LUT＋FA2组各细胞周期占比差异无统计学意义（P＞0.05）。
LUT及FA对AFB1染毒HEEC细胞凋亡的影响
分析实验结果发现，染毒组细胞凋亡率显着高于空白对照组（P＜0.05），表明AFB1促进HEEC凋亡。LUT干预组、联合干预组细胞凋亡率虽然高于空白对照组（P＜0.05），但显着低于AFB1染毒组（P＜0.05），说明LUT及FA抑制了AFB1的促凋亡作用。虽然FA单独干预后的细胞凋亡率与染毒组无显着差异，但联合LUT后显着抑制了AFB1的促凋亡作用，且该联合效应强于LUT单独干预组（P＜0.05）。
Western Blot检测MTHFR蛋白表达结果
AFB1染毒可以上调HEEC的MTHFR蛋白的表达（P＜0.05）。经LUT干预相比染毒组可下调细胞MTHFR蛋白表达（P＜0.05）。用FA进行干预，发现FA增强染毒细胞MTHFR蛋白的表达，20?μmol/L的FA干预能显着上调MTHFR蛋白表达（P＜0.05）；LUT联用不同浓度的FA干预能显着减弱AFB1对MTHFR蛋白表达的影响，作用强于LUT干预组（P＜0.05）。
MassARRAY甲基化检测HEEC的MTHFR基因启动子区甲基化情况
本次共获得了29 个有效单位信息，包括43 个位点。这些CpG单位的甲基化水平范围是0.00～74.00%，经统计分析，除CpG_6.7、CpG_16、CpG_35、CpG_42位点外，其余位点甲基化水平在染毒组和空白对照组中的差异无统计学意义（P＞0.05）。分析这几个位点的甲基化水平，结果显示染毒组甲基化水平显着高于空白对照组（P＜0.05）。比较CpG_6.7位点的甲基化水平，染毒组细胞甲基化水平显着高于空白对照组（P＜0.05），200?μmol/L FA组的甲基化水平显着低于染毒组（P＜0.05）；对于CpG_35位点，发现LUT组及LUT联用200?μmol/L FA干预组的甲基化水平显着低于染毒组（P＜0.05），与空白对照组接近（P＞0.05）；对于CpG_16、CpG_42位点，各干预组干预效果显着（P＜0.05）。
讨 论
综上，本研究发现AFB1抑制HEEC的增殖，阻滞其周期，促进凋亡，LUT对这些毒性作用有相应的改善；在AFB1可引起MTHFR高甲基化，LUT与FA及二者联合均可降低升高的甲基化水平，对该表观遗传改变具有调节作用，体现了抗AFB1毒性作用；MTHFR高甲基化的同时，蛋白表达水平也有所上调，LUT可以减少上调，改善AFB1对MTHFR蛋白表达的影响，而FA体现的是反向调节作用，考虑是MTHFR基因高甲基化导致的叶酸代谢紊乱，对其确认及机制的探讨有待进一步研究。
