通常采用混合接种策略，既确保了发酵的顺利进行，又保留了非酿酒酵母的发酵特征，对葡萄酒香气质量的提升有重要意义。对接种比例进行优化是混合酿造工艺中的关键点。利用具有优良酿酒特性的本土酵母有助于塑造葡萄酒的产区或地域典型性，非酿酒酵母与S. cerevisiae混合发酵作为当下的研究热点，是避免产品同质化、获得高品质葡萄酒的有效酿造方法。
目前关于P. kluyveri对葡萄酒香气影响的研究还不够充分，尚鲜见有关中国本土P. kluyveri与S. cerevisiae混合接种增香酿造的报道。西北农林科技大学葡萄酒学院的张文静、杨诗妮、叶冬青*和刘延琳*等人以课题组前期优选的本土P. kluyveri HS-2-1和S. cerevisiae NX11424为材料，按照小容器酿造工艺法探究不同接种比例的P. kluyveri对葡萄酒香气的影响。进一步研究优选P. kluyveri的酿造学特性，获得P. kluyveri与S. cerevisiae混合发酵酿造赤霞珠干红葡萄酒的最佳接种比例，旨在为改善国内葡萄酒单一风味、提高香气质量提供参考。
1 发酵曲线
如图1所示，所有发酵组均能完成发酵。SC组最快，历时7 d，PK组耗时最长，约11 d完成，不同接种比例混合发酵组（S1、S10、S20）均10 d左右完成发酵。发酵前2 d各处理发酵速率与SC组保持一致。但随着发酵进行，发酵速率呈现明显差异，SC＞PK＞混合接种发酵处理（S1、S10、S20）。与SC组相比，P. kluyveri的接入在一定程度上延缓了发酵进程，这是非酿酒酵母发酵能力相对较弱的体现。
2 发酵过程中活菌数变化
图2 为在不同发酵处理中4 个关键时期S. cerevisiae和P. kluyveri的菌落数变化。整体看，S. cerevisiae和P. kluyveri的菌落数在发酵过程中均呈现先上升后下降的趋势。由于接种比例的不同，混合发酵处理酒样中NX11424的生长受到不同程度的抑制。与SC组相比，混合发酵处理酒样中NX11424的最大增殖量和发酵结束后菌落数均降低，不同接种比例处理之间发酵结束后S.cerevisiae的菌落数无明显差别。
发酵过程中酵母菌之间存在竞争作用，随着发酵的进行，生长能力及耐受性更强的S.cerevisiae迅速占据主导地位，处于弱势地位的P. kluyveri菌落数下降较快。本实验中HS-2-1菌落数在ST2开始剧烈下降。此外，混合发酵处理中HS-2-1的最大增殖量和发酵结束后菌落数均显着高于PK组，且S10组的最大增殖量最高（1.30×108 CFU/mL），这可能与不同种属酵母之间存在生长协同作用有关，二者的互作关系有待进一步研究。实验结果表明，HS-2-1在葡萄酒酿造过程中具有良好的定植能力，在整个发酵过程中均能保持一定的生物量水平。混合接种不会影响乙醇发酵的正常进行，且在一定程度上能减缓HS-2-1的衰亡。
3 理化指标分析
结果显示，所有处理都完成了乙醇发酵，残糖质量浓度均低于4 g/L，乙醇体积分数约为13%。相较于SC组，其他处理酒样中总酸含量升高，挥发酸含量降低，其中PK组酒样总酸质量浓度最高（6.44 g/L），S1组酒样挥发酸质量浓度最低（0.25 g/L）。这可能由于菌株HS-2-1具有嗜杀特性，研究表明嗜杀酵母能够有效抑制发酵过程中腐败微生物的生长，净化发酵体系，从而降低挥发酸含量。
4 香气成分分析
对发酵后葡萄酒样进行香气分析，共检测到46 种物质，包括16 种高级醇类物质、19 种酯类物质、6种脂肪酸类物质以及5 种其他物质。各处理间香气物质组成种类没有显着差异，但物质含量存在显着差异。
各处理酒样中高级醇质量浓度均低于300 mg/L。与SC组相比，混合发酵处理（S10、S20）酒样中高级醇总量显着升高，其中S20组酒样中高级醇总量最高（176.92 mg/L），提高了24.19%。本研究发现高比例接种P. kluyvei的酒样中2-苯乙醇含量显着提高，其中PK组酒样中2-苯乙醇质量浓度最高（8.27 mg/L）。
与SC组相比，PK组酒样中异戊醇含量显着升高，提高21.26%。混合发酵处理酒样中只有高比例接种处理（S10、S20）酒样中异戊醇含量显着提高，其中S20组物质含量最高，提高38.31%。PK组酒样中癸醇含量较其他处理显着提高，3 组混合发酵处理葡萄酒中癸醇含量也较SC组显着提高，且其含量随着P. kluyveri接种比例的升高而降低。本实验中，与SC组相比，3 组混合发酵处理酒样中酯类物质总量均显着提高，且随着P. kluyvei所占比例的增加，酯类物质增幅越大。其中S20组酒样酯类物质总量为74.08 mg/L，较SC组中酯类物质总量高出21.34%。在检出的19 种酯类物质中，丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和9-癸烯酸乙酯5 种物质的OAV均大于1，对所得酒样香气的贡献更为显着。
检出19 种酯类物质，其中有5 种物质OAV大于1，分别为丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和9-癸烯酸乙酯。与SC组酒样相比，不同比例混合发酵处理均可促进以上5 种酯类物质的合成，有利于葡萄酒果香和复杂性的增强。其中，己酸乙酯具有最高的OAV（15.08～17.19），可以给葡萄酒带来浓郁的草莓、菠萝香气。S20组酒样己酸乙酯质量浓度最高（429.73 μg/L），为SC组的1.06 倍，但S1、S10组与SC组间差异不显着。此外乳酸乙酯能赋予葡萄酒特殊的乳香风味，与SC组相比，PK组酒样中乳酸乙酯含量较低，但混合发酵过程中乳酸乙酯含量显着增加，其中S20组酒样中乳酸乙酯含量最高（26.38 mg/L），为SC组（13.12 mg/L）的2.01倍。
本实验检出的6 种脂肪酸含量均低于感官阈值，有利于提高葡萄酒的复杂性。与SC组相比，各处理脂肪酸总量均降低，特别是各混合发酵处理中丙酸、异丁酸、异戊酸的含量均显着降低。在检出的其他物质中，β-大马士酮能够贡献葡萄酒中的甜香、花香和蜂蜜香。本实验中该物质在3 组混合发酵处理中含量较高，均超出感官阈值，但在SC组酒样中并未检测到，这可能与非酿酒酵母可产生较多的利于水解香气前体物质的糖苷酶相关。
为进一步判别不同处理之间香气成分的差异，对所有发酵香气成分进行PCA，结果如图3所示。在PCA模型中，PC1（40.66%）和PC2（39.69%）的累计方差贡献率为80.35%，能够反映样本的大部分信息。3 组混合发酵处理均位于PC1方向正端，其酒样中辛酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸异戊酯等香气物质含量丰富，而SC组位于PC1方向负向端，酒样中香气物质含量相对较少。PC2可将混合发酵处理（S1、S10、S20）酒样与PK处理酒样显着区分，主要贡献物质为己酸异戊酯、1-辛醇和3-甲基-1-戊醇等。由此可知P. kluyvei和S. cerevisiae混合发酵改变了纯种发酵时的呈香特征。
对酒样中OAV大于0.1的物质进行香气分组，选取∑OAV大于0.5的6 种香气类型绘制得到葡萄酒的香气轮廓图（图4）。所有实验酒样香气均以果香为主，其次为花香、焦糖味、脂肪味、化学味、植物味。相较于SC组酒样，接种P. kluyvei的葡萄酒样中果香、花香及焦糖味均有显着提高。这与混合发酵显着提高了样品中酯类、醇类及β-大马士酮等物质含量有关。植物味、脂肪味及化学味在低浓度条件有利于提升香气复杂度，所有处理中植物味和化学味强度无显着差别，但混合接种处理中脂肪味强度略有上升，这是由于混合发酵处理提高了葡萄酒中异戊醇、乳酸乙酯等物质的含量。
结 论
随着对非酿酒酵母酿造特性研究的深入开展，其在改善葡萄酒风味中的积极贡献被不断挖掘，与S. cerevisiae混合发酵作为有潜力的工艺措施也得到了广泛的关注。本研究选择本土P. kluyveri HS-2-1与S. cerevisiae NX11424以不同比例顺序接种酿造赤霞珠干红葡萄酒，发现HS-2-1和NX11424以20∶1比例接种，在确保乙醇发酵顺利完成的同时，能够最大限度地发挥P. kluyveri的产香特性，显着提高发酵酒样中己酸乙酯、丁酸乙酯等乙基酯类物质含量，使葡萄酒的果香和花香显着增强。因此，本研究认为本土P. kluyveri HS-2-1具有增香酿造葡萄酒的应用潜力。在后续研究中，将进一步细化其与S. cerevisiae的互作关系及对葡萄酒品质指标的全面影响，以期为葡萄酒增香酿造工艺技术的研发提供重要理论依据。
