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酸热诱导大豆分离蛋白纳米颗粒形成及其荷载姜黄素的特性

放大字体  缩小字体 发布日期:2020-08-20
核心提示:随着人们对膳食营养与健康的日益重视,功能性食品的开发己成为食品领域研究者的关注热点。姜黄素(Cur)是一种天然来源的疏水性多酚,具有一系列潜在有益的生物和药理作用,在功能性食品领域发展前景广阔。
   随着人们对膳食营养与健康的日益重视,功能性食品的开发己成为食品领域研究者的关注热点。姜黄素(Cur)是一种天然来源的疏水性多酚,具有一系列潜在有益的生物和药理作用,在功能性食品领域发展前景广阔。然而,Cur存在水溶性低、加工稳定性差以及生物利用度低等问题,严重制约了产业化应用及人群积极性反馈。与合成聚合物及其他生物大分子相比,蛋白质在生物相容性及环境友好等方面更具优势。其中通过纳米技术制备纳米级的蛋白载体还利于发挥Cur的尺度效应。作为现今食品工业生产和利用最广泛的植物蛋白,大豆蛋白市场可接受度高,且己有研究将其用于β-类胡萝卜素、香草醛和白藜芦醇等多种疏水活性物质的荷载。
 
  基于Cur在有机溶剂中的溶解特性,为了提高其包埋率,反溶剂法被广泛应用。但是反溶剂过程中消耗大量的有机试剂以及纯水,不符合现代食品工业环保绿色的生产原则。研究操作简便且绿色环保的物理方法制备大豆分离蛋白(SPI)-Cur纳米颗粒极具工业应用价值。
 
  华南理工大学食品科学与工程学院的袁丹、赵谋明和张思锐等人以SPI为原料,在特定pH值条件下(pH 7.0、5.9)静态加热处理(95 ℃、30 min)诱导SPI自组装形成纳米颗粒,分别记作HSPI及HSPI(pH 5.9),系统表征了它们的粒径、PDI、表面疏水性以及表观形貌,并利用荧光光谱研究它们与Cur的相互作用。通过均质或超声处理制备SPI-Cur纳米颗粒,探究蛋白-Cur纳米颗粒中Cur的水溶解度以及颗粒的性质和贮藏稳定性。
 
  1 SPI纳米颗粒的形成与表征
 
  1.1 颗粒粒径、分散性和表面疏水性
 
  实验首先利用DLS探究了pH 7.0及pH 5.9条件下加热对蛋白粒径及PDI的影响。结果显示,SPI虽然平均粒径小(<80 nm),但是粒径分布不均匀(PDI>0.5)。热作用使得SPI发生热变性形成聚集体,显着增加其平均粒径,但是同时增加其分散均一性。进一步通过ANS-法测定3 个蛋白样品的表面疏水性,结果表明,热处理可显着增加蛋白表面疏水性(P<0.05)。其中,pH 5.9条件下加热蛋白可使巯基转变成二硫键,而二硫键的周围常聚集着疏水性氨基酸,这使得HSPI(pH 5.9)的表面疏水性最高。
 
  1.2 形貌学
 
  为了更好地了解SPI纳米颗粒以及比较SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)三者的差异,通过TEM观察其表观形貌,如图1所示。SPI表面光滑,大部分为近乎球形颗粒,其颗粒大小不一;HSPI表面粗糙,颗粒感减弱,有明显的聚集体出现;而HSPI(pH 5.9)均为球形,表面较SPI略粗糙,颗粒大小均一,虽有部分聚集在一起,但仍以单独的颗粒呈现,表观粒径较SPI大;这些结果与DLS测得的结果一致。
 
  而加热使得肽段伸展并吸附在颗粒的表面,因此HSPI和HSPI(pH 5.9)的表面呈现粗糙状。得出结论,通过在95 ℃加热SPI溶液(pH 5.9)30 min诱导了SPI发生自组装,形成了具有核-壳结构的球形SPI纳米颗粒。此外,与DLS测定的平均粒径相比,TEM的结果普遍偏小,可能与空气干燥过程及颗粒在干燥过程中的结构收缩有关。
 
  2 SPI与Cur相互作用研究
 
  如图2A~C所示,在280 nm的激发波长处,SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)都呈现出强荧光强度,其中SPI在334 nm波长处具有最大荧光强度,HSPI和HSPI(pH 5.9)在340 nm波长处具有最大荧光强度。这一现象表明经过热处理后SPI内源疏水氨基酸所处微环境更加亲水。而随着加入的Cur浓度(0~10 μmol/L)增加,蛋白质的荧光强度逐渐降低,并且最大荧光发射波长发生蓝移,表明Cur与蛋白质的疏水性氨基酸发生了结合,使得它们所处的微环境极性降低,说明了Cur与SPI结合的作用力主要是疏水相互作用。
 
  为了更直接的表征两者结合的亲和力,通过Stern-Volmer方程计算Cur对SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)内源荧光的猝灭常数(Ksv)。以F0/F为纵坐标、Cur浓度为横坐标作图(图2D),经线性拟合后发现Cur浓度与SPI、HSPI和HSPI(p H 5.9)三者的F0/F值都呈现出良好的线性关系(R2≥0.99),表明Cur可均匀的结合在蛋白的疏水基团上。计算得到SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)与Cur结合的Ksv值分别为0.274、0.454、0.550 μmol/L,可以发现热处理SPI的Ksv值相比SPI显着提高(P<0.05),并且HSPI(pH 5.9)猝灭效果更加显着,说明HSPI(pH 5.9)与Cur之间具有更高的亲和力,这是HSPI(pH 5.9)表面疏水性高赋予蛋白的独特性质。
 
  Cur的固有荧光对其周围环境的极性高度敏感,因此,研究了不同SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)浓度下Cur的荧光特性。如图3所示,没有SPI的情况下在420 nm波长处激发游离Cur时呈现的荧光峰强度非常低。随着蛋白质量浓度(0~5 mg/mL)的增加,Cur的最大荧光强度也随之增加,这表明SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)有效提高了Cur的溶解性。另外,Cur的最大荧光发射波长从长波长向短波长变化,这种荧光峰的蓝移表明Cur向极性更小的环境移动。由图3还可看出,HSPI(pH 5.9)对于Cur荧光强度的提高相比SPI和HSPI更加显着,该结果与图2结果一致。综上,具有核-壳结构的HSPI(pH 5.9)纳米颗粒与Cur具有强结合亲和力,这主要是归因于Cur与蛋白质之间的疏水相互作用,这种核-壳结构对于提高Cur溶解性有显着效果,可用于荷载及递送Cur的潜在壁材。
 
  3 SPI-Cur纳米颗粒的形成与表征
 
  3.1 SPI-Cur中Cur的水溶性及其粒径和分布
 
  SPI-Cur纳米颗粒中Cur的含量是评价其对Cur是否成功包载及增溶的有效依据。将SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)与Cur粉末混合搅拌后经均质或超声,离心后得到的上清液为黄色、透明状液体(图4A),超声处理对SPI提高Cur水溶性更加有效,说明超声处理有利于蛋白与Cur之间的结合。
 
  值得关注的是,超声后HSPI(pH 5.9)可将Cur粉末在水中的溶解量提高至12.43 μg/mL,相比Cur粉末在水中的溶解度11 ng/mL,其溶解度提高了1 130 倍左右。除了HSPI(pH 5.9)蛋白自身表面疏水性高以及超声的驱动作用影响外,HSPI(pH 5.9)的核-壳结构中大量疏水基团形成的强疏水内核更有利于与Cur的结合也是主要原因(图5)。
 
  SPI-Cur颗粒的平均粒径及其分布如图4B所示,与SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)相比,均质后SPI-Cur、HSPI-Cur和HSPI(pH 5.9)-Cur颗粒粒径以及PDI大小的变化均不显着。与均质后样品颗粒相比,经超声处理得到的U-SPI-Cur和U-HSPI-Cur颗粒平均粒径均减小,但PDI值没有显着变化。与之不同的是超声后U-HSPI(pH 5.9)-Cur颗粒粒径虽略有增加,但分散性却依旧保持良好。
 
  3.2 蛋白-Cur纳米颗粒荧光光谱研究
 
  进一步利用荧光光谱研究蛋白-Cur纳米颗粒中蛋白质及Cur结构的变化。从图6A、B可以发现,经过均质或超声处理后,SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)的内源荧光最大发射波长均发生了红移,这可归因于均质和超声增加了蛋白的溶解度,使得疏水基团所处环境极性增强。由于Cur与蛋白结合,导致了蛋白内源荧光不同程度的猝灭,说明它们之间主要通过疏水相互作用而结合。此外,由蛋白-Cur纳米颗粒中Cur的荧光光谱结果表明超声处理后荧光强度比均质后更低,超声颗粒中Cur的最大发射波长红移,说明超声可以诱导SPI与Cur共组装。
 
  图6C、D对Cur荧光的研究结果表明SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)与Cur作用后,增强了Cur的荧光强度,改善了Cur的溶解性,超声处理后效果更加显着。无论是均质还是超声形成的纳米颗粒,都表明了HSPI(pH 5.9)与Cur结合的能力更强,蛋白质荧光猝灭和Cur荧光增强与蛋白-Cur纳米颗粒中Cur水溶性提高的结果一致。综上结果表明,超声处理可以增强SPI与Cur的相互作用,进而提高Cur的水溶性,HSPI(pH 5.9)的核-壳结构更有利于与Cur在均质和超声过程中的共组装形成均一分散性好的纳米颗粒。
 
  4 超声后蛋白-Cur纳米颗粒的贮藏稳定性
 
  为了考察蛋白-Cur颗粒(U-SPI-Cur、U-HSPI-Cur和U-HSPI(pH 5.9)-Cur)中Cur以及颗粒本身的贮存稳定性,在25℃贮存30 d进行监测。图7A显示,新鲜制备的U-SPI-Cur和U-HSPI-Cur中Cur含量迅速减少,第3天时上清液中Cur的保留率分别仅有50%和60%,随着贮藏时间的延长,Cur的保留率缓慢降低,而U-HSPI(pH 5.9)-Cur中Cur含量在7 d后才开始逐渐降低。在贮存30 d后,U-HSPI(pH 5.9)-Cur中Cur保留率为77%,远高于U-SPI-Cur(35%)和U-HSPI-Cur(44%)。从图7B、C可以看出,贮藏过程中,超声后形成的蛋白-Cur颗粒粒径和PDI均保持稳定。上述实验结果表明,相比SPI和HSPI,HSPI(pH 5.9)的核-壳结构对Cur的保护作用更佳,形成的纳米颗粒具有良好的贮藏稳定性。
 
  结    论
 
  本实验以SPI为原料,在pH 7.0和pH 5.9条件下对其进行静态热处理,得到了SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)3 种蛋白颗粒,其中HSPI(pH 5.9)是具有疏水核心和亲水壳的核-壳结构,它们均可通过疏水相互作用与Cur结合以提高Cur的水溶性。通过均质或超声等物理处理可成功制备SPI-Cur纳米颗粒,其中超声处理对于增强蛋白与Cur之间的相互作用更加显着。HSPI(pH 5.9)的核-壳结构更加有利于蛋白在超声过程中与Cur发生共组装,形成粒径小(<120 nm)、分散均一(PDI<0.2)的U-HSPI(pH 5.9)-Cur纳米颗粒,极大提高Cur的水分散性及贮藏稳定性。综上研究结果表明,HSPI(pH 5.9)可作为潜在的优质纳米级壁材用于Cur等疏水活性物质的包埋与输送。
 
 
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