先进检测技术如何帮助我们吃上健康油

地沟油问题一直是食品安全领域的热门话题之一，自地沟油问题首次曝光以来，即使在监管力度不断增加的今天，地沟油事件仍然时有出现。而在检测粮油和食品中所使用的食用油是否安全的时候，脂肪酸甘油脂类化合物则是最主要的检测指标物之一。

而食用油的检测往往需要在较短的时间内完成大批量样本数，因此，沃特世开发了一种利用中性丢失实现脂肪酸甘油酯类化合物的方法。脂肪酸甘油酯类化合物的结构相似，即以甘油的丙三醇结构为母体，结合1~3个脂肪酸，其碰撞诱导解离(CID)有比较一致的规律性，可以脱掉分子中的一个或几个中性脂肪酸。而这种检测方法正是利用这一结构与裂解规律。

方法通过使用Waters UNIFI科学信息管理平台，通过中性丢失功能，批量寻找油类样品中的脂肪酸甘油酯类化合物并对其结构进行初步判定；结合超高效合相色谱(UPC²)分离系统，建立了UPC²/QTof快速分离与定性分析脂肪酸甘油酯的方法，实现对脂肪酸甘油酯类化合物的快速、稳定分离，有效克服了液相、气相色谱分离的局限性。

该筛查分析的策略基于Waters高分辨质谱的专属全信息数据采集方式(MSE)。MSE是一种数据非依赖性(DIA)采集方式，母离子、碎片离子交替采集，无逻辑判断选择步骤，所以可以确保样品体系中的母离子、碎片离子的全部采集，而后续的数据解析与处理使用UNIFI科学管理平台，与MSE良好对接，根据保留时间、色谱峰形的微小差别进行母、子离子归属，并可以很方便的设置共同中性丢失、共同碎片离子作为筛选条件。

实验条件

样品前处理

植物油样品以正庚烷/异丙醇(7/3)配制成0.1 mg/mL溶液，离心，取上清液进样。

UPLC条件

系统: ACQUITY UPC²

色谱柱: ACQUITY UPC²HSS C₁₈(2.1 mm x 150 mm， 1.8 μm)

柱温: 40˚C

流动相 A: CO²

流动相B: 乙腈

ABPR: 2000 psi

进样量: 1 μL

补偿液: 5mM NH4Ac in MeOH/IPA(1/1)

补偿液流速: 0.3 mL/min

分离梯度:

MS条件

离子化模式: ESI+

毛细管电压: 3.0 kV

源温度: 150˚C

雾化气温度: 500˚C

雾化气流速: 800 L/h

采集模式: MS^E，高碰撞能量 30~60 eV(Ramp)

锥孔电压: 30 V

扫描范围: 50~1200 Da

数据采集

Masslynx MS^E全信息数据采集方式

数据处理

UNIFI科学数据管理平台，筛查分析工作流程

实验结果

分离是任何复杂系统定性分析的前提。本实验采用UPC²对脂肪酸甘油酯类化合物进行分离，克服了液相、气相色谱分离的局限性，分离效果好，分离容量高，图1是油类样品UPC²分离的总离子流图，由图可知，该方法质谱响应好，分离度高，会大大降低后续质谱解析的困扰，确保筛查分析的顺利进行。

图1. 油类样品UPC2分离QTof检测的总离子流图。

根据脂肪酸甘油酯类的裂解规律，选择以中性丢失作为重要筛查及判断依据。采集MS^E数据，将UNIFI对脂肪酸甘油酯的解析分为两条思路:1、目标脂肪酸甘油酯的筛查，将目标脂肪酸甘油酯及主要碎片离子信息存入数据库，以母离子精确质量误差，碎片离子匹配度进行定向筛选，结合中性丢失结果验证筛查结果的可靠性；2、未知脂肪酸甘油酯的查找与解析，以中性丢失为依据，将所有具有脂肪酸中性丢失的候选质荷比快速找到，并直观得到丢失的脂肪酸种类(UNIFI分析平台可以将结果自动按响应由高至低排序，方便解析)，进而通过UNIFI的Elucidate功能进行快速结构解析。

以甘油三酯(TAG)L-O-P(亚油酸-油酸-棕榈酸)为例，图2为甘油三酯L-O-P可能存在的裂解方式示意图，由图可以看出，该化合物容易脱掉一个或多个中性脂肪酸，得到碎片离子。但是预实验中发现，脂肪酸甘油酯类化合物，较易在ESI正离子模式下电离，且以+NH4的加合离子为主，也会有少量+Na、+K离子的产生，但几乎没有+H离子，而其碎片离子均为+H离子，图3为L-O-P的MSE图谱，可见一斑。

图2. 甘油三酯L-O-P的CID裂解规律。

图3. L-O-P的MSE图谱，上面为低碎裂能通道质谱图，下面为高碎裂能通道质谱图。

由以上获得的该类化合物的电喷雾(ESI)和碰撞诱导解离(CID)的规律，在UNIFI筛查分析方法中，设置相应的中性丢失，即在中性脂肪酸分子式的基础上，加NH₃，如图4所示，确保筛查结果的准确可靠(已验证若不加NH₃，筛查结果多为假阳性)。

图4. UNIFI筛查方法中，中性丢失列表的设置(脂肪酸分子式基础上+NH₃)。

在中性丢失查找过程中，发现目标化合物存在查找遗漏的情况，可能的原因是，脂肪酸甘油酯类化合物由于其脂肪酸链不饱和度的差异会出现质量数差2的情况，故某个质量数如876常会被系统识别为874的同位素峰，从而遗漏母离子876的结果。同样，碎片离子也会存在类似的情况，如脂肪酸甘油酯丢失不同脂肪酸分别产生603与605的碎片时，605可能也会被识别为603的同位素峰，从而遗漏丢失后产生605碎片的中性脂肪酸。针对这类化合物的普遍现象，将质谱峰(包括母离子、碎片离子)识别时所使用的同位素峰的个数由5改为2,有效解决了这一问题。

图5、图6、图7展示了利用UNIFI中性丢失来进行脂肪酸甘油脂筛查与确认的逻辑、流程等界面。

图5. 筛查思路1:目标脂肪酸甘油酯的UNIFI筛查。(以精确质量数和碎片离子匹配定向筛查，并以中性丢失结果验证筛查结果可靠性)

图6. 筛查思路2:未知脂肪酸甘油酯类化合物的筛查。(利用中性丢失进行未知脂肪酸甘油酯筛查。从中性丢失结果可以直观看出该候选质量数对应的化合物是否为脂肪酸甘油酯类，以及其含有的脂肪酸的种类)

图7. 未知脂肪酸甘油酯类化合物的结构解析。(采用UNIFI中Discovery一键式解析，综合元素组成/ChemSpider搜索/碎片离子匹配于一体，快速得到未知脂肪酸甘油酯的可能结构，该候选质荷比经解析确定为甘油三酯L-O-O，匹配上的碎片离子自动以蓝色小图标标注于质谱图中)

结论

本研究利用脂肪酸甘油酯裂解易丢失中性脂肪酸分子的特点，结合MS_E同时采集母离子及碎片离子，在UNIFI中设置中性丢失进行筛查，并对筛查出的候选化合物进行快速解析。该分析策略和方案也适用于其他裂解规律与特征明显的分析对象，即按照其化合物的类别进行有效的筛选，为在复杂的样品体系中实现对化合物的类别筛选分析大大拓宽了视野，提供了有力的分析手段。