但这并非个例，类似爆发的真菌感染，如脑膜炎、角膜炎等常见诸报端。2006年美国疾病控制和预防中心（CDC）的一项调查报告显示因真菌性角膜炎的发病率增加，从而导致博士伦大规模召回产品，并为此花费了近2.5亿美元的赔偿。
任何类型的真菌污染无疑都是需要深入追溯的，因此拥有对真菌到种水平的鉴定手段至关重要，它可以为调查溯源提供强有力的佐证。由于室内空气、水、人员和材料都可能是药厂发生真菌污染的来源，因此基于潜在的风险考虑，目前CGMP要求医药产品的生产必须通过严格的生产过程控制以保证质量，所以建立环境监测程序（EM）是无菌药品生产过程中最重要的组成部分之一，当然这同时也适合非无菌产品的生产过程。
为了很好的把握环境中微生物的变化趋势，许多生产商会选择对环境采集到的所有微生物进行鉴定，通过识别和定量微生物来衡量生产设备和生产环境的状态。多数情况下，在生产环境中发现的细菌通常能鉴定到种水平，但真菌鉴定，特别是霉菌鉴定目前还没有一个类似细菌鉴定的标准。这主要是由于现有的常规方法在鉴定真菌到种的水平能力还是有限的。
传统的真菌鉴定和其限制因素
真菌是一类特殊的真核微生物，大约有十万余种。在洁净室造成污染的真菌主要为霉菌和酵母两种。鉴定方法上，基于表型鉴定方法由于相对较低的成本，被大量实验室广泛地使用，但这往往需要有经验的技术人员才能胜任，比如对培养基、培养条件的选择等；此外表型鉴定还受到参考数据库的大小和类型的限制，这些数据库多是面向临床诊断而不是工业应用，所以基于这类数据库的鉴定结果往往存在一定的偏差。准确的鉴定结果对发现污染菌超标和溯源十分重要，错误的鉴定结果往往导致后续的消杀治理等工作并没有效果。近年来，分子生物学的发展，为真菌的准确鉴定提供了新的可靠的技术手段和鉴定渠道。
基因型鉴定
核糖体DNA序列用于生物分类已经使用了很多年。最近核糖体基因也已被用于对真菌进行亲缘关系的鉴定。虽然分类学家早已使用该技术进行真菌的系统发育分析、分类和重新分类，但是直接用于制药生产环境的真菌鉴定最近才开始得到普及，这主要是由于近期才有完整的检测产品或者第三方检测实验室为药企提供鉴定。如AB公司开发的MicroSEQ数据库，是一个基于DNA测序结果比对而进行微生物鉴定的产品，其初步提高了真菌鉴定质量，为相关企业鉴定提供了新的解决方案。
相比基于表型信息的鉴定结果，基因测序提供的数据具有更准确，重现性好的特点，这已被业界普遍认可和接受。美国食品和药物管理局（FDA）在2004年更新的指导文件中引入了遗传方法，在美国食品药品管理局“FDA无菌生产指南（FDA Guidance for Industry. Sterile Drug Products Produced by AsepticProcessing – Current Good Manufacturing Practice）”文件中，FDA强调在进行环境微生物监测方面，相比传统的生化和表型的技术，基因型的鉴定方法已经被证实具有更准确和更精确的优势，特别是在无菌测试、模拟灌装污染等的调查中具有重要的价值。cFDA于2015年12月1日开始实施的2015版药典中，在“9204 微生物鉴定指导原则”、“9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则”中也建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定，微生物菌群信息有助于预期常见菌群，同时也强化了通过测序进行基因型鉴定的概念。
现有的鉴定系统的局限性
尽管有了科学界和监管机构的支持和认可，但专家们也一致认为现有的商业识别系统仍有提高和改善的空间，包括其鉴定准确性和鉴定范围。首先，商业数据库中已知真菌的种类，它不应该仅仅体现在数量上，还应该体现出其生物特性，比如大多数据库都是基于临床的病原微生物，但对于药厂所关心的环境微生物的数据收集却很少，这样的数据库其实对于药企真菌鉴定来说价值并不大。其次，商业软件选择了特定的基因序列构建DNA数据库，这导致它只会基于该序列的信息进行鉴定，这同样也会影响到它的应用。
D2基因作为鉴定序列的局限性
在MicroSEQ系统里主要应用核糖体的大亚基的延伸序列D2作为检测对象。在大多情况下，它可以较好的将未知的真菌鉴定到属、科等水平，但是由于相近的真菌有非常相似的D2序列，此种情况下检测D2区域就达不到很好的区分效果了。举例来说，一些黑曲霉的株（Aspergillus niger）被重新分类为黑麴菌（Aspergillusbrasiliensis），其中最有代表性的是黑曲霉16404株（Aspergillus niger 16404）被重新分类为黑麴菌。但是几乎所有的表型试验和D2基因测序，都不能区分这两个种。由于缺乏形态学的多样性、不稳定的表型特征以及培养条件对表型的影响，表型很难用于区分不同的黑曲霉。另一方面，D2序列在所有的Aspergillus niger和Aspergillus brasiliensis种内都是一致的，因此也不能用于这两个种的区分。
D2序列在Aspergillus niger和Aspergillus brasiliensis两个种间不具备鉴定的能力
基于ITS2基因测序的优点
为了解决D2基因测序鉴定的局限性，相关研究发现核糖体操纵子中的ITS序列可更好的被应用于真菌的系统鉴定。在真菌的核糖体操纵子中有两个ITS区域。ITS1位于18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。整个rRNA操纵子一起转录，但转录后的rRNA，两个不具备功能的ITS被剪切掉。ITS序列作为一个间隔序列十分重要，但同时它又不具备功能，因此，它的突变速度会大于5.8S、18S和28S基因。这少量的突变提升，使得ITS的序列相比D2具备更好的多态性。因此，将ITS1-5.8S-ITS2整个测序有助于真菌分类。但是对于常规鉴定目的时，我所经过长期的实践和国际的研究团队均发现ITS2单独使用，通常足够用于真菌鉴定。
举例如将A. niger和A. Brasiliensis的ITS1-5.8S-ITS2进行全长测序后发现两个种之间有5个碱基的差别，而只用ITS2进行测序，发现有1个碱基的差别，但是这一个碱基的差别十分稳定，因此足以用来区分这两个种。
对ITS2参考数据库的扩展
影响鉴定的准确性不仅取决于用于识别的基因序列，而且还受制于鉴定所用到的数据库。获得最相关的、准确的和兼容的微生物库是实现正确的微生物鉴定的关键。
我所专注于微生物研究，很早就意识到只依赖于商业数据库是远远不够的，因此我们建立了制造环境中遇到的最全面的细菌和真菌的序列数据库，这使我们能够提供最高质量的鉴定结果。通过不断的维护和更新ExPharmDB，从而尽可能的确保我们的细菌和真菌数据库可以覆盖用户的需求。
