为证实免疫荧光的结果, 进一步采用Western blot方法检测了各组细胞在DNA DSBs损伤处理后 γH2AX蛋白表达水平变化情况。与IF的结果基本吻合, SMU1沉默组细胞内源性γH2AX蛋白表达水平明显高于对照siRNA组细胞,且DSBs形成后,其 γH2AX蛋白消退明显慢于对照组细胞(图4)。
2、讨论
人体每个细胞每天都会产生成千上万的DNA 损伤, 其中DNA DSBs是机体最致命的DNA损伤, 如果细胞不能及时修复, 将最终导致细胞死亡或恶性转化等严重后果。高等真核细胞已进化出一系列机制来修复DNA DSBs损伤, 当DSBs形成后, DNA损伤应答通路被激活, 相继征召多种修复蛋白到断裂位点, 启动DNA损伤修复过程。H2AX(组蛋白H2A变体)就是参与DNA损伤反应的较早期蛋白, 可在30 min内即可征召到双链断裂点, 其 139位丝氨酸被上游激酶ATM/ATR等磷酸化形成 pH2AXs139(γH2AX), 30~60 min内其激活可达顶点。γH2AX协同其他修复蛋白逐渐完成对损伤 DNA的修复过程, 随着DSBs修复完成, γH2AX逐渐从损伤部位消退。γH2AX用相应抗体染色后形成在荧光显微镜下可见的灶点(foci), 其foci数与细胞 DSBs数量密切相关, 因此γH2AX是检测细胞DSBs的敏感指标, 可通过检测其动态变化来评价细胞 DNA DSBs损伤应答反应的动力学变化过程。
SMU1是一个含WD40重复结构域的蛋白, WD40结构域可介导蛋白质之间的相互作用, 在蛋白质的功能发挥方面具有重要作用。tsTM18细胞的温度敏感性突变体型就是由SMU1 WD40重复区的第489位精氨酸被甘氨酸取代(G489R)引起的, 该突变导致细胞在非容许温度时呈现出增加的染色体断裂、异常的纺锤体组装及DNA单链断裂及细胞增殖活力的下降等基因组不稳定的表型。本研究采用 siRNA介导的基因沉默的方法, 发现SMU1基因表达下调可显着影响细胞的增殖能力, 这与上述研究结果基本一致。
X-ray辐射是造成DNA双链断裂的最主要原因之一。γH2AX分析的所需的损伤剂量及敏感性因不同的细胞而异, 肿瘤细胞系往往采用0.5 Gy以上剂量来分析γH2AX变化, 参考相关文献并经预实验我们发现, 2 Gy X-ray不仅可诱导细胞产生明显的 γH2AX表达, 而且其修复过程中的变化也比较明显。因此, 我们采用2 Gy X-ray作为DSBs损伤诱导剂, 并以γH2AX为DSBs的评价指标, 系统研究了SMU1对细胞的DNA DSBs损伤应答反应的影响。我们的结果显示, 未照射的细胞仅有极少数γH2AX形成, 但 SMU1沉默组细胞明显呈现更多的foci; 经X-ray处理 1 h后, 两组细胞γH2AX foci均达到最大值且无明显差异; 而从处理后1 h开始至8 h的时间段, 对照组细胞γH2AX foci急剧减少, 而SMU1沉默组细胞γH2AX foci下降趋势明显慢于对照组。
进一步的免疫印迹研究发现, γH2AX表达水平的动力学变化过程与免疫荧光γH2AX foci的变化过程基本一致。这些现象提示: (1)SMU1功能缺陷可能引起基因组不稳定造成更多内源性DSBs, 导致内源性γH2AX活化; (2)在 X-ray处理后短时间(1 h)内细胞产生大量的DSBs, 活化细胞DSBs修复信号, 正常情况下可在数小时内迅速修复损伤的DNA, 而SMU1缺陷细胞则因修复功能受损而导致DSBs长期存在。
综上所述, 本研究通过细胞计数、免疫印迹和免疫荧光等方法探讨SMU1在细胞增殖及DNA DSBs损伤应答中的作用, 初步阐明siRNA介导的 SMU1敲低可引起细胞增殖缺陷和DNA DSBs损伤应答反应动力学过程改变, 接下来我们将通过过表达一系列突变的SMU1来进一步研究确定其参与细胞DNA DSBs损伤应答的关键基因区段, 继续研究其具体的分子机制。
