羧甲基化修饰主要是在多糖的支链上引入羧甲基基团，据相关文献报道，羧甲基的引入可改善多糖的生物活性。基于此，来自广西医科大学药学院的韦毅铭、广西壮族自治区人民医院的何舟和百色市人民医院的田海芬等人对龙眼肉多糖进行了羧甲基化修饰，并优化其制备工艺，并对龙眼肉多糖修饰产物的分子质量、抗氧化活性、体内免疫活性等进行测定，以期对羧甲基化龙眼肉多糖（CM-LYP）理化性质和活性的影响有初步的了解，为龙眼肉多糖的进一步开发和利用提供理论依据。
1
多糖结构鉴定
CM-LYP在1603.43、1 420.15、1326.22 cm－1波数处出现了—CH2COOH的特征吸收峰，其中，1 603.43 cm－1波数处吸收峰为强峰，属C—O键非对称伸缩振动；在1 420.15、1 326.22 cm－1波数处2 个峰为中强峰，属羰基C＝O的对称伸缩振动和—CH—的变角振动峰。说明了羧甲基已成功引入到龙眼肉多糖的分子结构中。
2
CM-LYP制备工艺优化
2.1
单因素试验结果
MCA浓度对羧甲基化取代度的影响：随着MCA浓度的逐渐升高，取代度逐渐增大，当MCA浓度超过1.5 mol/L后，取代度下降。因此确定最优的MCA浓度为1.5 mol/L。
反应温度对羧甲基化取代度的影响：在40～70 ℃范围内，伴随反应温度的升高，取代度逐渐增大，随着温度的进一步提高，取代度开始下降，因此最佳反应温度应为70 ℃。
反应时间对羧甲基化取代度的影响：当反应时间为2.0～3.0 h时，取代度随着时间的延长而增大，3.0 h时取代度最高，超过3.0 h时，取代度出现下降，因此确定最优的反应时间为3.0 h。
2.2
羧甲基化龙眼肉多糖工艺优化
对响应面图进行分析，得出最佳工艺条件为MCA浓度1.2 mol/L、反应温度73 ℃、反应时间3.2 h，此时CM-LYP的羧甲基取代度达到1.057。
2.3
模型验证
实际获得的羧甲基的取代度与理论值相近，表明所建立的回归曲线数学模型预测性较好，也证实响应面法优选龙眼肉多糖羧甲基化工艺结果稳定、可行。
3
LYP、CM-LYP体外抗氧化活性测定结果
3.1 LYP、CM-LYP清除羟自由基能力
LYP、CM-LYP均具有清除羟自由基的能力，且呈现剂量依赖关系。从物质的量浓度考虑，LYP、CM-LYP、VC的IC50分别为4.67×10－5、3.44×10－6、4.80×10－4 mol/L，说明羧甲基的引入可以提高LYP对羟自由基的清除能力。
3.2 LYP、CM-LYP清除超氧阴离子自由基能力
LYP、CM-LYP对超氧阴离子自由基的清除率与质量浓度呈剂量相关。从物质的量浓度考虑，LYP、CM-LYP、VC的IC50分别为1.88×10－5 、3.24×10－6 、5.37×10-4 mol/L，说明羧甲基的引入可以增强LYP对超氧阴离子自由基的清除能力，且优于VC。
3.3 LYP、CM-LYP对小鼠肝匀浆脂质过氧化的影响
在一定范围内，LYP、CM-LYP、VC均可有效抑制小鼠肝匀浆自发性脂质过氧化反应，且与质量浓度呈现一定的剂量依赖关系。从物质的量浓度考虑，LYP、CM-LYP、VC的半数抑制浓度分别为7.78×10－6、3.60×10－6、1.34×10－3 mol/L，表明羧甲基的引入，可增强LYP抑制脂质过氧化能力，且优于VC。
3.4 LYP、CM-LYP对H2O2诱导的红细胞溶血的影响
随着样品质量浓度的增加，溶血抑制率逐渐升高，表明LYP、CM-LYP、VC均能抑制H2O2诱导的红细胞溶血，且其抑制能力与样品质量浓度呈现一定剂量效应。VC、LYP、CM-LYP的IC50分别为9.61×10－4、5.26×10－6、1.74×10－6 mol/L，表明羧甲基的引入增强了LYP的抗溶血能力，且优于VC。
4
体外免疫活性
4.1
LYP、CM-LYP对免疫抑制小鼠脾脏指数的影响
与正常对照组相比，环磷酰胺模型组脾脏指数显着降低（P＜0.05），说明本研究成功建立了环磷酰胺免疫抑制小鼠模型。与环磷酰胺模型组比较，阳性对照香菇多糖和不同剂量的LYP、CM-LYP均能显着的提高免疫抑制小鼠的脾脏指数且呈现剂量依赖效应（P＜0.05）。
4.2
LYP、CM-LYP对免疫抑制小鼠血清溶血素的影响
与正常对照组相比，环磷酰胺组小鼠血清的半数溶血值（HC50）显着降低（P＜0.05），说明本研究成功建立了环磷酰胺免疫抑制小鼠模型。阳性对照香菇多糖组、LYP组和CM-LYP组均能提高免疫抑制小鼠血清中的溶血素含量（P＜0.05），且这种变化呈现剂量依赖关系。以上结果说明LYP在80～160 mg/kg范围内、CM-LYP在40～160 mg/kg范围内能改善免疫抑制小鼠的体液免疫功能。
4.3
LYP、CM-LYP对免疫抑制小鼠脾脏和血清中溶菌酶的影响
与正常对照组比较，环磷酰胺组小鼠血清中的LZM含量显着降低（P＜0.05），说明免疫抑制小鼠模型建立成功。与模型组相比，阳性对照香菇多糖组（40 mg/kg）、龙眼肉多糖组（40～160 mg/kg）、羧甲基化龙眼肉多糖组（20～160 mg/kg）均显着地提高免疫抑制小鼠血清中L Z M 水平（P＜0.05），且这种变化呈现剂量依赖关系。
与正常对照组相比较，环磷酰胺组小鼠脾脏中的LZM含量显着降低（P＜0.05），说明免疫抑制小鼠模型建立成功。与模型组相比，阳性对照香菇多糖组（40 mg/kg）、龙眼肉多糖组（80～160 mg/kg）、羧甲基化龙眼肉多糖组（20～160 mg/kg）均明显提高免疫抑制小鼠脾脏中LZM水平（P＜0.05），且这种变化呈现剂量依赖关系。
4.4
LYP、CM-LYP对小鼠血清中IFN-γ和IL-4含量的影响
与空白对照组比较，CY组小鼠血清中的IFN-γ含量提升了3 倍以上（P＜0.05），主要偏向细胞免疫。随着LYP、CM-LYP给药剂量的增加，血清中的IFN-γ含量逐渐降低，表明Th1免疫应答模式减弱。当给药剂量超过80 mg/kg时血清中的IFN-γ含量稳定并处于正常水平（P＞0.05）。
与空白对照组比较，CY组小鼠血清中的IL-4含量下降显着（P＜0.05），主要偏向细胞免疫。随着LYP、CM-LYP给药剂量的增加，血清中的IL-4含量逐渐升高，表明Th2免疫应答模式增强。当CM-LYP给药剂量为80 mg/kg时血清中的IL-4含量接近正常水平（P＞0.05）。
结 论
抗氧化活性研究表明，在质量浓度为200～3 200 μg/mL范围内，龙眼肉多糖（LYP）、羧甲基化龙眼肉多糖（CM-LYP）的抗氧化能力与质量浓度呈剂量依赖关系，当剂量质量浓度达3 200 μg/mL时，LYP、CM-LYP对羟自由基清除率分别为（42.35±5.67）%、（84.39±4.47）%，对超氧阴离子自由基的清除率分别为（51.91±5.34）%、（87.91±7.32）%，对脂质过氧化的抑制率分别为（67.91±5.72）%、（79.85±2.92）%、对H2O2诱导的红细胞溶血的抑制率分别为（47.23±3.5）%、（54.66±2.83）%，表明羧甲基的引入增强了龙眼肉多糖的抗氧化活性。
体内免疫活性实验表明，羧甲基化龙眼肉多糖可提高免疫抑制小鼠的脾脏指数、促进血清溶血素形成、提高血清和脾脏中溶菌酶含量及调节Th1/Th2平衡，与修饰前龙眼肉多糖相比，羧甲基化龙眼肉多糖具有更好的免疫调节作用。
