来自四川农业大学食品学院的郑丽君、申光辉和张志清等人主要对真空包装免泡豆杆中优势腐败细菌进行分离鉴定，并比较分析耐高温腐败细菌对免泡豆杆的腐败能力，确定优势腐败菌及其对豆杆质构特性品质的影响，为免泡豆杆的杀菌防腐工艺条件研究提供参考依据。
免泡豆杆中腐败细菌的分离
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葡萄球菌、微球菌与热索丝细菌分离频率较低（0.01%），锰盐培养基上芽孢杆菌分离频率可达98.04%，其菌数对数值可达6.85～7.70（lg（CFU/g）），显着高于其他细菌数量。第1批样品中分离出了DY1a、DY1b两株芽孢杆菌；第2批样品中分离出了DY2a、DY2b、DY2c、DY2d四株芽孢杆菌；第3批样品里分离到1 株芽孢杆菌DY3。假单胞菌数最多可达5.5（lg（CFU/g）），第3批样品里分离得到两株假单胞菌DC3a、DC3b。气单胞菌数量波动较大，有1～2 个数量级差距。3 个批次样品中细菌种类相同，仅在数量上有所差异。
腐败细菌耐高温与产蛋白酶能力
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腐败细菌耐高温能力
菌株DA1、DA2、DS1、DS2、DM1、DM3、DY1a、DY1b、DY2a、DY2c、DY2d、DY3能耐受110 ℃、20 min的高温处理。
耐高温腐败细菌产蛋白酶能力
菌株DS2、DY3、DY1a、DY1b、DY2a、DY2d的HC值均高于2，菌株DY1a的HC值最高为3.15；其余菌株产蛋白酶能力相对较弱。
耐高温优势细菌腐败能力分析
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感官评价
通过观察比较，在37 ℃贮藏至第7天时，接种DY1a、DY1b、DY3、DY2a、DS1样品色泽暗淡，质地变软，表面出现黏液和不愉快刺激气味等腐败现象，已达到感官无法接受的程度，感官评分低于50 分；其余样品也开始出现不同程度腐败现象。
质构特征参数
与对照组比较，接种DY1a、DY1b、DY2a、DY3菌株的样品硬度显着降低，均在815 g以下，表明接种微生物样品的空间结构发生了较大变化；与对照样品相比，接种DY1a、DY2a菌株的样品弹性值均降低，但与对照差异不显着；除DY1a、DY3的内聚性低于0.60外，其余都在其之上，样品腐败程度与内聚性无显着相关性。空白样品的胶着性为858.73g，而接种DS2、DY1a、DY1b、DY2a、DY3的样品胶着性值分别为610.56、729.96、632.58、474.99、592.60g，均显着低于空白组，表明豆杆腐败后胶着性降低。同样，接种DA2、DS1、DS2、DY1a、DY1b、DY2a、DY3的样品耐咀性低于空白组，表明腐败导致耐咀性的降低。样品回复性值介于0.13～0.31之间，差异不显着。腐败程度越高，其硬度、弹性、胶着性、耐咀性越低，可以看出DY1a、DY1b、DY2a、DY3腐败较严重。
菌落总数
空白对照豆杆样品菌落总数对数值为5.86，表明样品仍残存有耐高温细菌，如耐热芽孢杆菌。而接种腐败细菌样品菌落总数对数值均大于7.0，其中DY3、DY1a、DY1b三株菌株的菌落总数对数值相对较高，分别为9.60、9.48、9.41，表明这3 株菌在免泡豆杆中的生长繁殖速度相对较快，是产品腐败点的优势菌，更易导致产品腐败发生。
TVB-N
对照组样品TVB-N为10.14 mg/100 g，除了DS1样品外其他数值均高于对照组，即表明实验样品已发生不同程度腐败。接种DY1a、DY1b、DY2a、DY2d、DY3的样品TVB-N均超过30 mg/100 g，即已发生腐败的严重程度高于其他菌株。其中接种菌株DY1a的豆杆样品TVB-N值最高，其次分别是DY1b、DY2a、DY3，结果与样品感官评价基本一致。
蛋白酶活力TVB-N
除DA1、DM3外，其他接种豆杆样品均有较高的蛋白酶活力。其中接种DY1a豆杆样品蛋白酶最高，为926.21 U/g。其次依次是接种DY1b、DY3、DY2a、DS2、DA2、DY2c、DA1豆杆样品。样品蛋白酶活力越高，表明该菌株对豆杆大豆蛋白的分解能力越强，腐败程度越高。
pH值
除了DA1、DA2、DS1、DS2、DM1、DY1a、DY1b、DY2a、DY2c、DY3，其他腐败样品的pH值均低于空白对照组。
优势腐败菌致腐能力比较
4 株腐败菌腐败能力大小依次为DY1a＞DY1b＞DY3＞DY2a，与感官评价结果一致。菌株DY1a、DY1b、DY2a、DY3为免泡豆杆的耐高温优势腐败菌。
腐败细菌鉴定
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形态特征与生理生化特性
菌株DY1a、DY1b、DY2a、DY3在PCA平板上37 ℃培养24 h后，菌落均呈圆形或椭圆形，边缘不规则，液体静置培养有菌膜产生。菌株DY1a、DY1b菌落乳白色不透明，表面干燥；菌株DY2a、DY3菌落透明，外层有透明圈，表面光滑湿润。4 株菌菌体细胞分别呈长杆和短杆状，革兰氏染色阳性。
4 株腐败细菌均可利用葡萄糖、侧金盏醇、木糖、棉子糖，分解尿素；靛基质、葡萄糖酸盐、赖氨酸、鸟氨酸实验结果呈阳性；MR、VP、苯丙氨酸、硫化氢实验结果呈阴性。菌株DY1a、DY1b不能利用山梨醇，菌株DY1a、DY2a不能利用枸橼酸盐。
16S rRNA序列分析
菌株DY1a、DY1b与暹罗芽孢杆菌、死亡谷芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌均在同一分支；菌株DY2a、DY3与枯草芽孢杆菌、莫哈韦芽孢杆菌、B. axarquiensis、B.malacitensis聚在同一分支。细菌16S rRNA序列分析是目前确定细菌分类地位的常用分子生物学手段。由于16S rRNA的高度保守性，对相似率极高的近缘种（如芽孢杆菌属、假单胞菌属等）只能做到属水平上的鉴定，无法进行不同种的有效聚类区分。本研究利用16S rRNA序列测序结果构建菌株系统发育树，发现其与芽孢杆菌属的多个种相似度均在99%以上，且聚在16S rRNA系统发育树的同一分支，并不能与其他种的模式菌株明显区分开，因此采用16S rRNA序列并不能将4 株腐败芽孢杆菌准确鉴定到种，不少研究者也得出了相同结论。
gyrB基因序列分析
菌株DY1a（GenBank登录号：KY315725）、DY1b（GenBank登录号：KY315726）与解淀粉芽孢杆菌聚在同一分支，gyrB基因序列同源性为100%；菌株DY2a（GenBank登录号：KY315727）、DY3（GenBank登录号：KY315728）和枯草芽孢杆菌聚在同一分支，gyrB基因序列同源性为100%。故将菌株DY1a、DY1b鉴定为解淀粉芽孢杆菌；菌株DY2a、DY3为枯草芽孢杆菌。
结 论
从腐败样品中共分离获得20 株不同的腐败菌，其中有12 株可耐受110 ℃、20 min高温处理，且具有较强的产蛋白酶能力。回接验证实验结果表明，接种4 株优势耐高温腐败菌的免泡豆杆样品，37 ℃贮藏至第7天发生明显腐败变质，样品TVB-N、蛋白酶活力及pH值显着高于未接菌对照样品；此外，硬度、弹性、胶着性、耐咀性等产品质构特性也显着低于对照样品。4 株优势腐败菌均为芽孢杆菌，通过比较TVB-N产量因子确定腐败能力最强的是解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）DY1a，其次依次分别为解淀粉芽孢杆菌DY1b，枯草芽孢杆菌（B. subtilis）DY3和DY2a。
