来自中国海洋大学食品科学与工程学院的宋佳、张娜、李晶等以力竭运动小鼠构建过度疲劳模型，以公认的益生元——低聚果糖为阳性对照，采用转录组技术探究新琼四糖对过度疲劳性肠道损伤的保护作用。本实验研究新琼四糖对肿瘤标志蛋白表达的影响，探究其保护机体、预防结肠肿瘤发生的功效，为功能食品研究提供新思路，并为新琼四糖的开发利用提供参考。
1. RNA质量控制
4 组RNA琼脂糖凝胶电泳图谱可知，28S亚基和18S亚基条带清晰，且各组RIN值均大于8，表明RNA完整，可用作转录组学测序分析。测序文库构建过程中，RNA均被打碎成（142.00±5.00） bp的片段（正常组（142.30±32.60） bp、模型组（145.60±32.70） bp、低聚果糖组（144.90±33.20） bp、新琼四糖组（145.50±32.60） bp，均小于200 bp），可实现深度测序。模型组对正常组小鼠的每个基因平均标准化counts的变化值，模型组引起基因差异表达数量较大，1 053 个基因显着变化。
2. 过度疲劳对肠道基因表达的影响
通过和基因文库进行比对，模型组中18 804 个表达基因的名称及功能得到确认。其中2 987 个基因显着表达（P＜0.05），44.66%基因表达上调（fold change≥1.10），35.99%的基因表达下调（fold change≤0.90）。在众多基因中，有89 个基因确定为锌指蛋白家族基因（P＜0.05，|1－fold change|≥0.05），为显着表达中所含个体最多的一类蛋白。其中，有20 个锌指蛋白功能集中在肿瘤相关方面（P＜0.05），12 个锌指蛋白促进肿瘤增殖或在肿瘤细胞中表达量增加，6 个锌指蛋白可抑制肿瘤增殖或在肿瘤细胞中表达下调，2 个锌指蛋白可能与肿瘤有关。通过比较模型组和低聚糖组结果发现，低聚糖引起的模型组中表达量改变的基因个体，和模型组对正常组基因引起表达改变的基因个体有重合（P＜0.05，|1－fold change|≥0.05），进一步对比发现，模型组中上调的基因，在低聚糖组中会发生下调；模型组中下调的基因在低聚糖组中会发生上调（P＜0.05，|1－fold change|≥0.05）。在低聚果糖组中，25 种显着变化的锌指蛋白中有9 种，即Zfp521、Zfr、Zmynd8、Zbtb38、Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp512、Zmat2均涉及肿瘤发生。模型组中锌指蛋白Zfp521表达上调1.2 倍（P＝0.004）。2 种锌指蛋白Zmynd8和Zfp503，模型组中其表达量均上调（P值分别为7.56×10－5和0.009），上调程度均为1.20 倍。
新琼四糖组中，11 种显着变化的锌指蛋白涉及肿瘤增殖、神经传递、T细胞免疫等多种功能，其中有5 种，即Zmynd12、Zfp521、Zmynd8、Zfr、Zbtb7c锌指蛋白与肿瘤形成相关。模型组中，前3 种锌指蛋白显着过表达，上调程度分别为1.23、1.20 倍和1.20 倍。对于这些在模型组中表达显着增加的肿瘤正相关锌指蛋白，新琼四糖和低聚果糖都表现出抑制或缓解增加的作用。
3.转录组分析技术预测低聚糖功能特性的可行性分析
低聚果糖的加入抑制了肿瘤正相关锌指蛋白的转录表达。锌指蛋白Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp521、Zmat2、Zbtb38、Zfr、Zmynd8表达量均显着降低（P＜0.05），且相较于模型组，表达量下降不低于10%。低聚果糖的加入抑制了肿瘤正相关锌指蛋白的转录表达。锌指蛋白Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp521、Zmat2、Zbtb38、Zfr、Zmynd8表达量均显着降低（P＜0.05），且相较于模型组，表达量下降不低于10%。
模型组Cyclin A1、 Cyclin A2、 Cyclin D1表达显着上调（fold change分别为1.25、1.22、1.33，P＜0.05，P＜0.01），在低聚果糖组其表达均与模型组相比极显着降低（fold change分别为0.84、0.82、0.86，P＜0.01）。该结果提示，低聚果糖可能通过影响锌指蛋白，间接抑制细胞周期蛋白表达，延缓细胞进程，从而降低肿瘤发生风险。此外，低聚果糖对抑癌因子有促表达作用。模型组中Casz1的表达显着降低（P＜0.05），显着上调Casz1蛋白的表达（P＝4.99×10－3）。Zfp346，又称为JAZ，通过介导细胞周期阻滞和凋亡来抑制癌细胞增长。
4.新琼四糖对锌指蛋白基因表达的影响
与低聚果糖组相似，锌指蛋白基因Zfp521、Zmynd8、Zfr在新琼四糖组中与模型组相比也呈现显着下调趋势（fold change分别为0.88、0.89、0.92，P＜0.05，P＜0.01）。Zmynd12为转录因子，模型组基因表达量为正常组的1.23 倍（P＜0.01）。新琼四糖组与模型组相比其表达显着降低（fold change为0.93，P＜0.05）。除此之外，对于其他肿瘤正相关锌指蛋白均有下调的影响趋势，同时增加了抑癌因子的表达。抑癌因子Casz1和Zfp346的表达上调，细胞周期蛋白Cyclin D1表达明显被抑制（fold change为0.91），对Cyclin A1、Cyclin A2也起到抑制效果。
结 论
用转录组学分析技术对新琼四糖进行功能性研究发现其对显着增加的肿瘤正相关锌指蛋白Zfp521、Zmynd8和Zfr等有明显的抑制作用，并且同样促进了抑癌因子Casz1、Zfp346表达量的增加，降低肿瘤发生风险性。转录组结果表明，低聚果糖通过抑制肿瘤增殖锌指蛋白Zfp345、Zfp13、Zfp503、Zfp521、Zmat2、Zbtb38、Zfr、Zmynd8的表达，激活抑癌因子基因Casz1和Zfp346表达，调控细胞周期蛋白和细胞分化进程，而减少细胞数量，延缓肿瘤增殖趋向，展现了其对肿瘤的抵抗潜力。本研究尝试建立转录组技术辅助功能成分功效预测新方法，为功能食品研究提供了技术参考。采用此方法对新琼四糖进行功能预测，发现其对过度疲劳引发的肠道损伤具有保护作用。
