来自东北农业大学乳品科学教育部重点实验室的张秋雪、刘晓婵、朱宗涛等拟采集3~6 个月纯母乳喂养婴儿粪便,采用纯培养技术分离其中的长双歧杆菌,进一步利用16SrDNA、hsp60、RAPD和MLST技术分析分离得到的长双歧杆菌多样性,为深入研究长双歧杆菌在婴儿健康中的作用和功能提供理论支持。
分离菌株形态及生理生化实验结果
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分离菌株的菌落菌体形态
从11 个健康母乳喂养的婴儿粪便中分离得到18 株疑似菌株。菌落乳白色或白色、凸起、光滑且边缘水润。18 株菌均为革兰氏染色阳性,菌体排列不规则,菌体形态为杆状,且杆状末端分叉,呈V或Y字、顿圆、哑铃等形态。
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生理生化实验结果
18 株分离株均为专性厌氧菌,过氧化氢酶实验、明胶液化实验、氧化酶实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验均为阴性,无运动性。
分离菌株的基因同源性分析
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16S rDNA同源性
18 株分离株PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,在1 500 bp左右处有明亮单一条带,满足测序要求。有10 株菌与长双歧杆菌的同源性均达到99%。其余8 株分别为两歧双歧杆菌2 株、假小连双歧杆菌1 株、动物双歧杆菌乳酸亚种4 株、短双歧杆菌1 株。
构建系统发育树,发现有7 株菌(H3-R1、H9-5、H10-1、H16-2、H20-14、H27- 10、H27-13)均与长双歧杆菌长亚种ATCC15707 16S rDNA亲缘关系最近,初步确定为长双歧杆菌长亚种;3 株菌(H5-19、H5-21、H11)与长双歧杆菌婴儿亚种 ATCC15697 16S rDNA亲缘关系最近,初步确定为长双歧杆菌婴儿亚种。
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hsp60同源性分析
10 株长双歧杆菌的hsp60基因PCR扩增后电泳,在650 bp左右处均有明亮单一条。构建无根进化树,发现7 株菌(H3-R1、H9-5、H10-1、H16-2、H20-14、H27-10、H27-13)与长双歧杆菌长亚种JCM1217的亲缘关系最近,并结合以上结果判定为长双歧杆菌长亚种;3 株菌(H5-19、H5-21、H11)与长双歧杆菌婴儿亚种 JCM1222的亲缘关系最近,并结合以上结果判定为长双歧杆菌婴儿亚种。
长双歧杆菌多样性的分析
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RAPD分析结果
不同引物的扩增片段数目为1~7 条之间,片段分子质量大小在0~1 kb之间。综合4 个随机引物的扩增图谱可知,长双歧杆菌H3-1、H9-5、H10-1、H20-14、H16-2、H11分别具有差异条带图谱,属于不同株型;H27-10和H27-13、H5-19和H5-21具有相同条带图谱,属于同一株型。
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MLST的分析结果
(1)等位基因电泳及测序
选取7 个等位基因,运用设计好的等位基因引物对长双歧杆菌等位基因扩增。10 株长双歧杆菌的7 个等位基因均扩增成功,且有明亮单一条带,满足测序要求送样品进行测序。
(2)长双歧杆菌的等位基因分型
将10 株长双歧杆菌分为8 个ST型,且均与ATCC15707为不同的ST型。7 株长双歧杆菌长亚种分为6 个基因型,其中菌株H3-R1、H9-5、H10-1、H20-14、H16-2分别属于不同ST型,而菌株H27-10和H27-13属于同一ST型。3 株长双歧杆菌婴儿亚种分为2 个基因型,其中H5-19和H5-21属于同一ST型,且与H11为不同ST型。
(3)长双歧杆菌等位基因系统发育树构建
分离于H5婴儿个体的H5-19和H5-21菌株为相同ST型,分离于H27婴儿个体的H27-10和H27-13号菌株为相同ST型。
结 论
本研究从11 个健康婴儿体内分离鉴定得到10 株长双歧杆菌,7 株为长双歧杆菌长亚种,3 株为长双歧杆菌婴儿亚种。多态性分析发现:7 株长双歧杆菌长亚种为6 个基因型,3 株长双歧杆菌婴儿亚种为2 个基因型,说明婴儿肠道中长双歧杆菌存在较大的遗传多样性。