基于微生态制剂具有通过调节肠道菌群结构来维持机体与肠道菌群动态平衡的作用，加之一些学者开展了水苏糖（Sta）、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、两歧双歧杆菌功效的研究。因此，来自天津商业大学生物技术与食品科学学院的臧凯丽、江岩和中国肉类食品综合研究中心的孙勇等人以便秘和腹泻人群为对象，在不同微生态制剂的干预下，通过对受试者粪便DNA提取，利用Iontorrent PGM测序平台探究受试者肠道菌群结构信息的变化，同时利用气相色谱检测粪便中的SCFAs表达水平，解析微生态制剂干预前后肠道菌群多样性的变化及其与SCFAs代谢相关的关键菌属的相关性，比较Sta、益生菌纯粉（PP）以及益生菌剂（PPrs）在调节肠道菌群结构和代谢SCFAs产物方面的能力，研究结果将为鉴定并阐述微生态制剂解决便秘和腹泻相关的肠道关键菌属的关系提供科学数据，也为通过微生态制剂以肠道菌群为靶点来调整、治疗便秘和腹泻提供新的途径。
1.肠道菌群16S rRNA V3区测序文库的检测
最终获得的V3区测序文库大小集中在260 bp左右，完全符合细菌16S rRNA基因V3区平均长度为180 bp的要求，即测序长度可以覆盖V3区全长。
2.服用微生态制剂后肠道微生物α多样性的分析
2.1多样性指数分析
各组样本的OTU数目随着测序深度的增加基本达到饱和，具有很高的测序覆盖率，说明当前测序深度足以发现各样本生境中的大部分物种。
2.2肠道菌群多样性变化
服用不同微生态制剂后志愿受试人群肠道菌群的Ace指数的变化：Ace指数反映了各组受试人群肠道菌群的物种丰富度，从中可看出3 种微生态制剂对肠道菌群的影响具有一定差异，其中，Sta和PP组受试人群肠道菌群丰度远不及PPrs组，说明PPrs对肠道菌群的多样性调节作用更明显。
PPrs组受试人群服用第1周后，肠道菌群的生物群落结构多样性明显好转，随着服用时间的延长，逐渐与Ctro组接近，而且在停止服用后，肠道生物群落结构多样性也没有大幅度降低，说明PPrs对调节肠道菌群结构具有良好的作用。
与PPrs不同的是，服用PP的受试人群的肠道菌群的生物群落结构多样性在第1周没有明显好转，随着服用时间的延长，向Ctro组接近，并且停止服用后，肠道菌群的生物群落结构多样性恢复了原有状态。而Sta组受试人群肠道菌群的群落结构多样性明显低于其他组，但在服用Sta期间，肠道菌群的生物群落结构多样性有升高的趋势，而且在停止服用Sta后，肠道菌群的生物群落结构多样性较服用前有所升高，说明Sta也具有调整肠道菌群结构的作用。
3.微生态制剂对肠道菌群整体结构的影响
3.1肠道菌群结构分析
根据服用不同微生态制剂的关系进行连接，发现服用微生态制剂组样本与Ctro组有交叠的趋势，各组样本并不能完全分开，说明相比较其他因素，微生态制剂对肠道菌群结构的调节作用更为明显。
根据样本中相对丰度的距离自然聚类为两簇，沿第一主成分也是贡献率最大的主成分（64.68%）完全分离，根据数据提示这与Prevotella和Bacteroides的相对丰度相关。此外， PP组样本在X轴上距离较大，说明在PP干预下肠道菌群结构多样性变化较大；PPrs组人群的肠道菌群结构逐渐向Ctro组靠近，提示PPrs具有更强的改变肠道菌群失调的能力。
3.2不同分类水平相对丰度的分析
在门的水平上， 主要有放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、硬壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）及蓝藻细菌门（Cyanobacteria），其中绝大多数序列属于Bacteroidetes和Firmicutes，约占总序列数的94.37%。Sta组的肠道菌群结构中Firmicutes相对丰度有一定的增长，由14.08%升至22.4%，而Bacteroidetes和Proteobacteria相对丰度下降明显。PP组便秘人群的肠道菌群结构中Bacteroidetes相对丰度明显增加，而Firmicute、Proteobacterias和Actinobacteria都相应减少；而腹泻人群的Bacteroidetes相对丰度明显减少，只有Firmicutes明显增加。PPrs组腹泻人群在干预期间肠道菌群结构中除Firmicutes有较明显的减少外，Actinobacteria、Bacteroidetes和Proteobacterias都相应有所增长；而便秘组除Bacteroidetes外，Actinobacteria、Proteobacterias和Firmicutes都有明显有增长。
从整体结构中可以看出不同受试人群肠道菌群结构中科和属水平的差异较明显，服用微生态制剂后，属的相对丰度明显增加。健康受试人群的肠道菌群以Bacteroidales为核心菌属，而便秘和腹泻受试人群则以Bacteroidales、Prevotellaceae和Ruminococcaceae为主。就腹泻受试人群的肠道菌群而言，服用Sta和PPrs后，Bacteroidales和Prevotellaceae占相当大的比例，而服用PP后的Bacteroidales所占比重较大。便秘受试人群的肠道中以Prevotellaceae和Ruminococcaceae为主，服用PP后Bacteroidales的相对丰度降低，而服用PPrs的受试人群肠道菌群中这3 种菌属似乎处于一个相对平衡的状态，这需要进一步去挖掘；此外，Bifidobacterium、Lactobacillus、Parabacteroides这些常见的外源性益生菌均在受试者肠道菌群有增长迹象。
为了更好地体现微生态制剂作用下的肠道菌群相对丰度的分布，在属水平做了菌属丰度的分布热图，并进行了聚类，结果如图7所示。对比Sta组、PP组和PPrs组受试人群的肠道菌群，肠道中与产SCFAs相关的菌属都属于相对丰度较高的菌属，多属于Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Lactobacillaceae、Clostridiaceae、Bacteroidetes、Prevotellaceae、Enterobacteriaceae、Desulfovibrionaceae和Rikenellaceae。此外，PPrs中的Bifidobacteriaceae、Lactobacillus和Parabacteroides有益菌虽然占有的丰度不高，但是在服用微生态制剂后明显有增长的趋势。在受试人群的肠道菌群中Citrobacter等可能性致病菌被检测出，随着服用微生态制剂时间的延长，其相对丰度降低。为进一步得到更多的信息，还需从中选择差异显着的菌群进行具体分析。
4.肠道菌群结构中差异显着的关键菌属鉴定
4.1肠型分析
在干预前， 健康人群肠道菌群内的Bacteroides相对丰度较高且稳定，便秘和腹泻人群肠道菌群中Bacteroides的相对丰度比Prevotella高。经过服用微生态制剂后，Sta组和PPrs组腹泻人群中的Bacteroides随时间呈下降趋势，相对丰度由高于50%降到低于20%，相应的Prevotella随时间呈上升趋势， 肠型由Bacteroides 型转换到Prevotella型；而便秘人群的Prevotella和Bacteroides的相对丰度会随着服用微生态制剂有所改变，变化比例没有使肠型改变。
4.2关键菌属鉴定
总体而言，PPrs对肠道结构影响较明显。Sta组、PP组和PPrs组3 组受试人群的肠道菌群与产SCFAs相关的科、属都有明显增长，相较其他两种制剂，PP组受试人群产SCFAs相关菌属的相对丰度增长明显，尤其是Lachnospiraceae中的Blautia、Lachnospira以及Ruminococcaceae中的Faecalibacterium、Oscillospir等，其中Blautia和Faecalibacterium与SCFAs含量呈显着正相关。
相对丰度数据中约有14%的变异度能够被健康、便秘与腹泻环境变量所解释，能够代表便秘和腹泻与健康人群肠道菌群结构差异显着相关的关键菌。
位于3 种状态下的菌均有显着不同，腹泻状态下的肠道菌群多样性要明显低于便秘和健康状态。其中健康状态丰度较高的菌属多属于Lachnospiraceae、Veillonellaceae、Streptococcaceae、Erysipelotrichaceae等产SCFAs细菌。腹泻状态下Megamonas的丰度较明显，可能属于腹泻的关键菌，有待进一步探究。便秘状态下肠道菌群处于较复杂的状态，其中Ruminococcaceae、Rikenellaceae、S24-7、Clostridiales、Prevotella以及Lachnospiraceae、Veillonellaceae、Erysipelotrichaceae等产SCFAs菌数量较多。
5.微生态制剂对粪便中SCFAs表达水平的影响
与Ctro组相比，服用不同微生态制剂后，SCFAs含量存在显着性差异。服用Sta后，丙酸含量显着增加，乙酸与丁酸也在2 周左右有所增加，随着服用时间延长尤其是停止服用后，SCFAs的含量基本有所增加。腹泻人群肠道菌群结构单一，服用PPrs后肠道菌群多样性增高。受试人群在服用PP期间，不论是便秘还是腹泻状态，只有乙酸的含量增加，丙酸和丁酸甚至呈现降低的现象。尤其腹泻人群在停止服用后SCFAs含量有着显着差异。
结论
绝大多数序列属于硬壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），约占总序列数的94.37%。随着微生态制剂的摄入，受试人群肠道菌群的群落结构多样性明显增加，毛螺菌科（Lachnospiraceae）中的Blautia、Lachnospira以及瘤胃菌科（Ruminococcaceae）中的Faecalibacterium、Oscillospir等与产SCFAs相关的菌属都明显地增长，其中Blautia和Faecalibacterium与SCFAs含量呈显着正相关。SCFAs的含量以及肠道中相应菌群的增长与减少都与微生态制剂的成分相关，在3 组受试人群中，服用Sta组，丙酸含量显着增加，乙酸与丁酸含量也在2 周左右有所增加，并伴随产SCFAs的菌属快速且大量增长；PP组肠道中只有乙酸含量有所增加，丙酸和丁酸含量呈现降低的趋势，而产SCFAs的菌属增长较明显；服用PPrs组，乙酸和丁酸含量明显增加，且便秘和腹泻人群在停止服用后，其SCFAs的含量接近于健康人群，常见的Bifidobacterium、Lactobacillus、Parabacteroides等外源性益生菌均明显增长，可能性致病菌相对丰度降低，表明服用PPrs对肠道菌群结构的调节作用以及影响更大。此外，根据肠型的分析，Bacteroides和Prevotella在饮食的共同驱动下会调整并改变肠型，而仅通过所选择的微生态制剂的作用，在驱动肠型改变方面不显着。综上所述，肠道疾病状态的人群服用微生态制剂后，肠道菌群结构向正常人群的状态调整，菌群多样性和SCFAs表达水平提高，表现出持续抑制肠道有害细菌生长，促进有益菌的增殖，以此来维持肠道菌群结构的稳态。经扩增子测序分析获得初步结论为：微生态制剂有改变腹泻、便秘人群肠道菌群整体结构的功效，并且PPrs要比单一的Sta或PP调整肠道菌群的能力更突出。
