来自中国水产科学研究院南海水产研究所的吴燕燕、钱茜茜、朱小静和李来好等人主要采用Illumina MiSeq测序技术研究调理啤酒鲈鱼片采用气调包装在－3 ℃贮藏过程中微生物群落结构差异及优势腐败菌组成，并与未经调理处理的鲈鱼片比较，以期探究贮藏过程的微生物群落结构及差异，为更好地抑制腐败菌的生长、优化产品工艺、延长啤酒鲈鱼调理产品货架期、提高产品质量提供理论依据。
1、鲈鱼片在贮藏过程中微生物α-多样性分析
在0～10000的测序数量范围内，随着测序数量的增加，稀释曲线急剧上升，且斜率较大，在10000～40000的测序数量范围内，稀释曲线缓慢上升并趋向平坦，进入平台期，说明本研究测序数据量合理，测试深度足以反映样品中绝大多数的微生物信息，即使再增加测序数量也不会产生新的OTU。由A、B两组样品的α-多样性指数箱图可知，其中物种观察指数反映样品中群落的丰富度，香农指数反映群落的多样性。鲈鱼制品在贮藏过程中微生物多样性逐渐趋向单一，调理啤酒鲈鱼片B.1组的微生物多样性比对照组A.1低，但是在B.2组和B.3组微生物多样性比对照组A.2和A.3丰富。
2、OTUs数目统计及物种注释分析
对照组L0过滤后得到的拼接序列数共有58707 条Tags，在97%的序列相似性条件下，可分为766 个OTUs，包括54422 条可获得分类信息的Tags，4275 条低频Tags；而实验组TL0共获得64345 条Tags，在97%的序列相似性条件下，可分为210 个OTUs，包括63906 条可获得分类信息的Tags，422 条低频Tags。
3、OTU花瓣图分析
为了找出不同贮藏阶段样品中的核心微生物，利用OTU花瓣图作进一步分析。从鲈鱼制品在贮藏过程中细菌OTU花瓣图分析结果，可以很直观地看出，在不同的贮藏时间，细菌多样性存在很大差异，但各个贮藏时间里又都含有共同的OTU数。调理啤酒鲈鱼片TL组在微冻贮藏0～50 d过程中共有61 个核心OTU，对照组（L组）在4 ℃贮藏0～10 d过程中共有21 个核心OTU，说明鲈鱼制品在贮藏过程中有些微生物一直存在，对鱼肉的品质变化有重大影响。从鲈鱼制品在两种不同包装不同贮藏条件下的细菌OTU花瓣图分析结果可知，鱼肉在不同包装方式和不同贮藏条件下，核心优势微生物共有75 个核心OTU。
4、物种的分布情况
4.1 基于门水平的菌群结构分析
从门水平描述了鲈鱼制品贮藏过程微生物菌群结构变化。本实验自定义最大丰度排名前10的菌群为优势菌群。鲈鱼制品在贮藏过程中的优势微生物为：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes），且在整个贮藏过程存在，说明这3 种微生物对鲈鱼的品质起着重要的作用，在今后的研究中可以重点探究其在鲈鱼品质变差的过程中的作用。对照组中的优势微生物厚壁菌门相对丰度在4 ℃冷藏过程中先上升后下降，变形菌门相对丰度在整个贮藏过程中持续上升，在货架期终点时达到最高，为73.2%，拟杆菌门相对丰度则在4 ℃冷藏过程中持续下降。气调包装的调理啤酒鲈鱼片中的优势微生物厚壁菌门相对丰度在整个－3 ℃微冻过程变化幅度不大，变形菌门相对丰度呈微弱上升的趋势，拟杆菌门相对丰度逐渐较小。
4.2 基于属水平的菌群结构分析
由鲈鱼制品在贮藏过程中的微生物丰度聚类图可知，对照组鲈鱼片在贮藏第0天时优势菌为：鲸杆菌属（Cetobacterium）、优杆菌属（Eubacterium）、另枝菌属（Alistipes）。贮藏第2天时微生物发生了变化，优势菌以乳球菌属（Lactococcus）、生丝微菌属（Hyhomicrobium）、梭杆菌属（Cetobacterium）为主。第4天时微生物以索丝菌属（Brochothrix）、肉食杆菌属（Carnobacterium）为主，索丝菌广泛存在于环境中，是肉类食品中重要的腐败菌，也是导致真空包装肉制品在冷藏条件下腐败的主要微生物。说明从第4天开始，对照组中的鲈鱼片开始出现索丝菌属常见的腐败微生物，品质开始变差，有腐败变质的迹象。第6～8天肉食杆菌属、气单胞菌属（Aeromonas）快速生长。第10天时，嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、索丝菌属、假单胞菌属丰度迅速增大，甚至出现了希瓦氏菌属（Shewanella），并且成为主要优势微生物，造成鲈鱼片的彻底腐败变质。
调理啤酒鲈鱼片中的微生物群落结构较对照组发生了变化， 贮藏第0天主要包括克雷伯氏杆菌属（Klebsiella）、拟杆菌属（Bacteroides）、埃希氏杆菌属（Escherichia）、韦永氏球菌属（Veillonella），而且还出现了一种新的微生物Lachnoclostridium；埃希氏杆菌属的检出说明产品可能受到了一定程度的污染。第10天时优势微生物包括寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）和未分类的菌。第20天时盐单胞菌属（Halomonas）、短波单胞菌属（Brevundimonas）成为主要优势微生物，同时出现了假单胞菌属和希瓦氏菌属等腐败菌。气调包装的调理啤酒鲈鱼片中微生物种类和丰度明显低于对照组，说明气调包装中的CO2对微生物有一定的抑制作用。对照组鲈鱼片在冷藏过程中优势菌的种类波动较大，A .1时存在的优势菌属主要包括密螺旋体属（Treponema）、真杆菌属（Eubacterium）、乳球菌属、生丝微菌属、梭杆菌属，到了A.2时，菌相逐渐开始变的单一，索丝菌属、肉食杆菌属开始成为优势腐败菌，贮藏A.3时，索丝菌属、肉食杆菌属减弱，漫游球菌属（Vagococcus）丰度增强并成为优势菌，同时出现了较多的气单胞菌属（Aeromonas）、希瓦氏菌属、嗜冷杆菌属。而调理啤酒鲈鱼片－3 ℃微冻贮藏过程中优势微生物种类在贮藏B.1和B.2变化不大，但在贮藏B.3时发生了较大变化，整个贮藏过程中的微生物种类也和对照组不同，说明鲈鱼的加工方式、包装方式和贮藏温度影响着微生物多样性。贮藏B.1的主要优势菌为埃希氏杆菌属、拟杆菌属、克雷伯氏杆菌属，Lachnoclostridium为次要优势微生物，贮藏B.2时，之前的主要优势菌丰度逐渐减弱，次要优势微生物Lachnoclostridium的丰度增强，同时出现了盐单胞菌、短波单胞菌属，假单胞菌属也开始生长繁殖。假单胞菌广泛存在于土壤、水和动植物体表中，容易导致肉类变黏，代谢产生过氧化物或H2S使肉类变色。随着贮藏时间的延长，优势微生物结构波动较大，多样性增加，假单胞菌属、不动杆菌属、嗜冷杆菌属的主导地位越来越显着，成为主要优势腐败菌。
结 论
鲈鱼制品在贮藏过程中的优势微生物为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）；真空包装的未调味鲈鱼片在4 ℃贮藏过程中微生物多样性比在－3 ℃贮藏的气调包装调理啤酒鲈鱼丰富，且在贮藏第4天时，开始出现了索丝菌属（Brochothrix）等常见的腐败微生物，到第10天时，索丝菌属、假单胞菌属（Pseudomonas）丰度迅速增大，出现了希瓦氏菌属（Shewanella），造成鲈鱼片彻底腐败变质；气调包装的调理啤酒鲈鱼片在第20天时才开始出现假单胞菌属和希瓦氏菌属等腐败菌，之后在CO2的抑制作用下，腐败菌丰度逐渐减小，直到货架期终点时，假单胞菌才迅速增长，且出现了嗜冷杆菌属（Psychrobacte），造成了鲈鱼制品的彻底腐败变质。这说明气调包装联合啤酒调理的加工方式及－3 ℃贮藏可以有效延长产品的货架期。
