来自山东农业大学食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室的郑振佳、乔旭光*和齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室的张瑞凌等人以牛蒡提取物的乙酸乙酯相为研究对象，基于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）筛选模型建立高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联三重四极杆飞行时间质谱（HPLC-DAD-Q-TOF-MS）在线筛选鉴别自由基清除剂的方法对牛蒡中天然抗氧化活性成分进行快速筛选和鉴定，为食品及中药等复杂体系中抗氧化活性成分的筛选提供技术参考。
1、牛蒡抗氧化成分提取结果
本实验分别考察50%乙醇溶液超声提取和回流提取2 种方式对牛蒡化学成分的提取效果，结果表明回流提取30 min的效果优于200 W超声提取1.5 h，故采用回流方式进行提取。
2、HPLC条件优化结果
结果表明，在实现较好分离的目标下，乙腈-0.1%甲酸溶液体系洗脱时间为50 min，甲醇-0.1%甲酸溶液体系洗脱时间为70 min，且前者的分离效果优于后者。
3、抗氧化活性成分在线筛选结果
DPPH浓度是影响筛选灵敏度的一个重要因素，信噪比随着浓度的增加而相应增加，同时基线噪音和基线波动也随之增大。研究分别考察2×10－4、1×10－5 mol/L和6×10－5 mol/L三个浓度下的筛选效果，结果表明DPPH-甲醇溶液浓度为6×10－5 mol/L时的筛选效果最佳，因此选取该浓度作为筛选浓度。
4、紫外吸收情况考察结果
从全波长扫描结果来看，该样品中具有抗氧化活性化合物的紫外吸收情况具有高度相似性，主要成分的紫外吸收最大波长在216、240 nm和320 nm附近，初步判断为结构类似物，且样品中大多数化合物在300 nm波长处有特征肩峰，判定为咖啡酰奎宁酸类系列化合物。
5、抗氧化成分的Q-TOF-MS鉴别
参考文献并与山东省分析测试中心国家天然产物参比实验室自有的绿原酸、咖啡酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸甲酯、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰奎宁酸共9 种对照品进行比对，对照品的色谱峰分别对应图3中的峰1、2、3、4、6、7、8、11和峰12共9 个化合物。峰5、9和峰10分子质量相同，根据极性大小和二咖啡酰奎宁酸的出峰顺序推断峰5为1,5-O-二咖啡酰-3-O-苹果酰奎宁酸，峰9为3,4-O-二咖啡酰-3-O-苹果酰奎宁酸，峰10为3,5-O-二咖啡酰-3-O-苹果酰奎宁酸。峰13分子质量与峰5、峰9和峰10相差14，相差的基团为—CH2—，根据参考文献和已发现化合物的信息推断峰13为1,5-O-二咖啡酰-3-O-苹果酸甲酯奎宁酸。
结 论
本研究建立在线筛选鉴定抗氧化活性成分方法，实现牛蒡乙酸乙酯相中抗氧化活性成分的在线筛选与鉴定，结果显示牛蒡中重要的抗氧化成分主要为咖啡酰奎宁酸类化合物。本方法快速、准确，与紫外分光光度计法和传统天然产物中复杂成分的分离与鉴别模式相比，具有更高的筛选效率；与前期的MS鉴定方法比较，新增活性筛查以及采用部分对照品进行确证，从而保证结果更加准确。由于咖啡酰奎宁酸类化合物结构类似且存在多种同分异构体，在无对照品的前提下，即使通过多级质谱也难以实现精准鉴定。对于未明确具体名称的咖啡酰奎宁酸类化合物，需在后期研究中通过多种色谱技术制备获得高纯度单体，结合核磁共振二维谱实现结构确证。
