植物甾醇（PS）是一类存在于食物中的天然化合物，其酯化产物即植物甾醇酯（PSE）具有较好的溶解特性。前期研究发现PSE可显着减轻NAFLD大鼠肝脏的脂肪变性程度。为进一步研究PSE干预后如何影响肝脏代谢物的变化，来自上海交通大学农业与生物学院的欧阳鹏凌、管玘、丁信文、宋立华*等人拟在前期研究基础上，利用高脂饮食诱导建立NAFLD大鼠模型，同时通过灌胃不同剂量PSE连续干预12 周后，检测肝脏总脂肪含量，利用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）技术检测PSE对NAFLD大鼠肝脏小分子代谢物的影响，从代谢组学的角度进一步阐明PSE有效预防NAFLD的机制。
1、PSE干预对NAFLD大鼠摄食量的影响
1～9 周内，随着大鼠周龄的增加，各组大鼠的摄食量均有所增加，其中实验至第9周后，NC组及PSE-H组大鼠摄食量较接近，与之前相比无明显变化，而HF组及PSE-L组摄食量较之前略有下降。这可能是由于高脂饲料热量较高，引起大鼠食欲下降，而高剂量PSE可更好地调节脂代谢，因此使大鼠保持正常食量。事实上后期代谢检测结果也发现，PSE-H组大鼠的代谢情况与NC组更接近，提示高剂量PSE（相当于人每天摄入6 g）可能会更好地发挥调节脂代谢作用。
2、PSE干预对NAFLD大鼠体质量的影响
实验初始时间各组大鼠体质量无显着差异；从第6周开始至实验结束HF组大鼠体质量一直高于其他组，到第12周时HF组大鼠体质量最高，PSE-L组次之。表明高脂饮食会导致体质量增加，有肥胖的趋势，而本实验中高剂量PSE干预可减缓体质量的增长。
3、PSE干预对肝组织总脂肪含量的影响
HF组较NC组肝脏脂肪含量极显着升高（P＜0.01），而PSE-L和PSE-H干预组大鼠肝脏中总脂肪含量均较HF组极显着下降（P＜0.01），PSE-L和PSE-H两组肝组织脂肪含量接近。
4、肝组织代谢物检测不同前处理方法比较
在正、负离子模式下，500、750 μL溶剂量较250 μL溶剂量在8～10 min内，出峰数目更多，且峰形更好，而负离子模式可以看出，750 μL溶剂量下其响应较低。为了增强代谢物的提取效果，最终选择在50 mg肝脏组织中加入500 μL的溶剂（乙腈、甲醇、水体积比2∶2∶1）作为提取条件。
5、PSE干预对肝组织部分小分子代谢物的影响
多维统计分析
为了更好地区分组间差异，提高模型的有效性，过滤与模型分类不相关的正交信号，采用PLS-DA方法对样品进行进一步分析，得到在正离子模式下R2Y＝0.54，负离子模式下R2Y＝0.77。HF组与PSE-L组分布差异较小，而PSE-H组与HF组区分明显。
差异代谢物的确认
根据低能量图谱可以看到，准分子离子峰为m/z 522.3545[M＋H]＋，磷脂酰胆碱（18∶1（6Z）/0∶0）的精确相对分子质量为521.348 14 。该物质的高能量质谱图中部分碎片离子，通过比对UNIFI软件中给出的磷脂酰胆碱（18∶1（6Z）/0∶0）结构并结合其裂解规律，推断出该物质是磷脂酰胆碱（18∶1（6Z）/0∶0）。按照此方式，采集分析正负离子模式下得到的差异代谢物后，筛选出20 种差异代谢物，其中19 种为脂类，1 种差异代谢物为胆汁酸类。用HMDB（http://www.hmdb.ca/）、lipidmaps（http://www.lipidmaps.org/tools/）、Pubchem（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）、KEGG（http://www.kegg.jp/）等数据库以及文献对差异代谢物进行搜索，了解其作用和所参与的代谢通路。
与HF组同一代谢物响应值相比较，NC组中代谢物离子强度水平低于或者高于HF组时，PSE-H组中也表现出相同的趋势，进一步提示高脂饮食条件下，高剂量PSE干预可有效减轻脂代谢紊乱，大鼠代谢状况与正常对照组更接近。
HF组与NC组比较，20 种差异代谢物均有极显着性差异（P＜0.01）。总体来看，PSE-H组差异代谢物强度变化趋势与NC组更接近，其中PSE-H组中的磷脂酰乙醇胺（20∶3（8Z，11Z，14Z）/22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）、22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）/17∶1（9Z））、磷脂酰甘油（17∶2（9Z，12Z）/22∶6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z））、磷脂酸（20∶1（11Z）/0∶0）、磷脂酰胆碱（16∶0/16∶1（9Z））离子强度较HF组显着下降（P＜0.05）；磷脂酸（16∶0/20∶2（11Z，14Z））、磷脂酰胆碱（16∶0/18∶1（11E）、18∶1（6Z）/0∶0）、18∶1（9Z）/18∶0、20∶3（8Z，11Z，14Z）/0∶0）、鞘磷脂（d18∶0/16∶0）、甘氨胆酸、溶血卵磷脂（1 8∶1（9Z）、20∶3（5Z，8Z，11Z）、20∶3（8Z，11Z，14Z））、磷脂酰胆碱（15∶0/18∶1（11Z）、16∶0/2∶0）、17∶1（10Z）/0∶0）、19∶3（10Z，13Z，16Z）/0∶0）的离子强度较HF组极显着降低（P＜0.01）；而磷脂酰胆碱（20∶4（5Z，8Z，11Z，14Z）/14∶0）则有明显上升（P＜0.05）。
代谢通路分析
通过筛选影响值，得到由溶血卵磷脂以及磷脂酰胆碱参与的甘油磷脂代谢通路，该通路的影响值为0.18333。红色部分为本实验检测出在甘油磷脂代谢通路中的差异代谢物：磷脂酰胆碱（15∶0/18∶1（11Z），16∶0/16∶1（9Z）），以及溶血卵磷脂（18∶1（9Z），20∶3（5Z，8Z，11Z），20∶3（8Z，11Z，14Z）。这5 种VIP＞1的差异代谢物在HMDB、PubChem以及KEGG数据库中的编号。由代谢通路分析提示PSE可通过对纠正高脂饮食诱导的甘油磷脂代谢紊乱，发挥其对NAFLD的预防作用。
结 论
本实验运用UPLC-Q-TOF-MS技术研究PSE干预对NAFLD大鼠肝组织小分子代谢物的影响，筛选出20 种差异代谢物，分别为参与甘油磷脂代谢通路的磷脂类和胆汁酸类，研究结果发现PSE干预后可降低肝组织中溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油的含量，提示其可通过甘油磷脂代谢通路调节脂类代谢紊乱，减轻高脂饮食诱导的肝脏脂质积累，从而抑制NAFLD的发生发展。
