沈阳农业大学食品学院的孔繁华、曹雪妍、岳喜庆*等人旨在利用多重光谱相结合的技术研究木糖醇（XY）与Cs的相互作用机制以及对Cs结构和功能特性的影响。拟采用荧光猝灭法研究XY对Cs的猝灭机制，判断二者之间是否存在相互作用，并计算二者的结合常数、结合位点、结合距离以及相关的热力学参数，探讨二者的相互作用机制；利用同步荧光光谱法研究XY主要结合的氨基酸残基；利用三维荧光光谱法研究XY对Cs中氨基酸残基微环境极性的影响，进而推测对Cs构象的影响；采用傅里叶变换红外光谱和圆二色谱法分析评价Cs二级结构及相对含量的变化，进一步验证XY与Cs相互作用的存在，此外还对复合物的乳化性和表面疏水性进行测定，从而为XY在乳制品中的添加及功能性乳基料的开发提供理论参考依据。
1、内源性荧光光谱分析
Cs自身含有3 种生色基团——色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。当在280 nm波长激发时，普通具有荧光的蛋白质分别在348、303、282 nm波长处出现吸收峰，强度比约为Trp∶Tyr∶Phe＝100∶9∶0.5。纯Cs溶液的最大发射波长（λmax）约在350 nm处，可以判断促使Cs发荧光的主要是Trp残基。
2、XY与Cs的猝灭效应
根据公式用F0/F对CQ作图，可以得到Cs与XY相互作用的Stern-Volmer曲线，根据图中的直线斜率可以计算出公式中的Ksv和Kq。F0/F与CQ呈现出良好的线性关系，说明在反应过程中只存在一种猝灭机制。3 个温度下的Ksv值随着温度的升高而变小，符合静态猝灭的规律。而且XY对Cs猝灭的速率常数Kq大于生物大分子的最大动态猝灭速率常数2.0×1010L/（mol·s），因此，可以判断XY对Cs内在荧光猝灭效应的机制主要是通过与Cs形成新的复合物的静态猝灭。
3、结合常数（KA）及结合位点数（n）的计算
可以看出，XY与Cs之间至少存在一个结合位点。结合常数KA较大，数量级在106左右，随着温度的升高，KA逐渐降低，表明在结合过程中生成的复合物Cs-XY不稳定，当温度升高时，复合物可能部分分解。KA和n的值都随着温度的升高而下降，与前文中Ksv的趋势一致，再次证明该过程的猝灭机制属于静态猝灭。
4、热力学参数与作用力
XY与Cs相互作用的过程中?G＜0，表明该结合过程是自发进行的；?H＜0，?S＞0，说明Cs与XY之间的相互作用属于放热反应，反应中的主要作用力为静电引力，但是考虑?S＞0，所以也不排除疏水性相互作用在其中起作用。
5、同步荧光光谱分析
随着XY用量的增加，Cs 两个不同波长差的同步荧光光谱均明显降低，这与前人研究锦葵-3-O-葡萄苷对牛乳α-Cs和β-Cs同步荧光光谱影响的结果相似，表明Cs分子中的Tyr和Trp均由于XY的加入而被不同程度的猝灭，但相比之下，Trp的被猝灭程度要大于Tyr，由此可以判断XY主要结合在Cs的Trp残基上；此外，?λ为60 nm的谱图表现出明显的蓝移现象，而?λ为15 nm谱图的出峰位置几乎没有变化。
6、三维荧光光谱分析
从峰的强度来看，随着XY浓度的增加，两种峰都变的稀疏，说明加入XY后瑞利散射峰和荧光峰的强度均有不同程度的降低，说明色氨酸和酪氨酸残基附近的微环境发生了变化，进而可以推测XY与Cs间存在相互作用，且二者能够形成复合物，并改变Cs的微环境和构象，这与同步荧光的结果一致。
结论
通过利用荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱、傅里叶红外光谱和圆二色谱的多光谱组合法探究XY对Cs光谱性质以及结构的影响，并测定了其乳化性和表面疏水性的变化，有助于更好地理解牛乳蛋白质和XY之间的结合过程中涉及的化学机理，为功能性乳基料的生产提供理论依据。具体得出以下结论：1）XY对Cs的荧光猝灭机制是静态猝灭，生成了Cs-XY复合物，结合常数较大，且随着温度的升高而降低，说明生成的复合物不稳定。二者至少存在一个结合位点，结合距离为3.56 nm，结合过程是一个自发的放热反应，主要作用力是静电引力和疏水作用力。2）XY的结合位点更接近于色氨酸，使色氨酸周围的微环境变得更加疏水，从而引起Cs的结构发生部分变化，进一步说明Cs与XY发生了相互作用。3）傅里叶变换红外光谱和圆二色谱的结果表明，与XY相互作用后，Cs的α-螺旋结构相对含量从54.91%降至44.97%，其他组分的相对含量略有增加，结构更趋向于紧密状态，证明XY的存在确实会影响Cs的二级结构。4）在XY的作用下，随着XY浓度的增加，Cs的乳化活性降低，乳化稳定性增加，表面疏水性降低，证实了Cs的结构发生了变化。
