多数乳酸杆菌携带有数个质粒，大小不一，其中多数质粒为隐蔽性质粒，少数质粒具有某些特殊功能。目前，已有许多乳杆菌质粒被测序，并用于构建质粒载体。国内开展的乳酸菌天然质粒的分离及功能分析的研究较少，导致利用基因工程手段对乳酸杆菌的改良受到严重限制。由于乳酸菌是食品级的益生菌，其携带的质粒也是食品级的，不存在食品安全问题。
因此，华南农业大学兽医学院的方来杉、黄毓茂*和广州沃德生物技术有限公司的赖强等人对从酸菜中分离的植物乳杆菌LP3中的内源性质粒pLP3进行全序列测定及功能分析，并利用该质粒的复制子构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒D-pLP3，并研究该质粒的宿主范围、转化效率和稳定性。在穿梭质粒pLP3的基础上加上启动子PslpA和绿色荧光蛋白（eGFP）基因，进一步构建乳酸菌表达载体D-pLP3-PslpA-eGFP，并将其转化至植物乳杆菌，获得荧光蛋白的表达。该质粒可为乳酸菌基因操作提供新的工具，为构建具有自主知识产权的乳酸杆菌的表达载体提供基础资料。
一、质粒分离和单酶切图谱
电泳结果显示植物乳杆菌LP3的质粒提取液有3 条带（图1），提示该菌株携带多个质粒。其中一个质粒大小在2 kb左右，另外2 个质粒大小在15 kb以上。将小质粒（2 kb左右）进行纯化回收，并命名为pLP3。对pLP3质粒分别采用限制性内切酶EcoRI、XhoI、AvrII、SpeI进行酶切分析，最终发现该质粒经EcoRI、XhoI、AvrII、SpeI酶切均获得线性化质粒，而且是唯一的线状质粒DNA条带，不存在其他大小的DNA条带（图2）。
二、质粒序列的验证
构建的重组质粒PUC-pLP3，在EcoRI酶切位点附近设计引物pLP3-F/R，通过PCR验证所测序列是完整的（图3）。
三、质粒注释和复制方式推定
3.1 质粒注释
pLP3质粒是双链环状DNA分子，共2 017 bp，GC含量为37.48%。BLAST比对结果显示：该质粒的核苷酸序列与植物乳杆菌KLDS 1.0801中的质粒pLD1（2 112 bp，GenBank：FJ755814.1）、pC30il（2 140 bp，GenBank：J03319.1）最为相似，相似率分别为99%与98%。
通过开放阅读框（ORF）搜索，pLP3有7 个ORF，ORF3编码一个含317 个氨基酸残基的蛋白，位于177 888～18 411 130 bp，应为pLP3质粒的Rep蛋白，该Rep氨基酸序列与Lactobacillus的同源性为100%，与植物乳杆菌的质粒Rep蛋白（NCBI Reference Sequence：WP_012569251.1、WP_010889864.1、WP_010889864.1等）的同源性均为99%，317 个氨基酸中有1 个氨基酸不同。ORF5编码一个含48 个氨基酸残基的蛋白，位于515～661 bp，其与植物乳杆菌（NCBI Reference Sequence：WP_107724356.1）未知功能的假定蛋白相似性为100%。其余ORF在GenBank没有与之相匹配的蛋白。目前为止，由于质粒pLP3除具有与复制相关的蛋白外，未发现具有特定功能的蛋白质，因此质粒pLP3应归为隐蔽性质粒。
ORF3编码质粒的Rep蛋白，在rep基因下游的10 bp处有一段反向重复序列，该序列是rep基因的转录终止信号（transcription termination signal），与pC30il质粒rep基因的转录终止信号序列一致。通过重复序列检索发现pLP3质粒的623～768 bp有9 个重复序列，该重复序列CATGATAATG正向重复了9 次，重复序列可能和质粒的拷贝数有关。在rep基因上游的272 bp处观察到典型的质粒的复制双链起点（dso），该保守序列为5’-CGG TTTCTTCTTATCTTGATACTATTAGCAACAAC-3’，与RCR质粒pC194家族的dso同源。该质粒的复制单链起点（sso）为ssoA类型，其保守序列为TAGCGA/T位于489～494 bp。
3.2 质粒复制方式推定
将比对完成的DNA序列进行注释，初步确定质粒复制相关蛋白（图4）。用植物乳杆菌质粒复制起始相关蛋白RepA和RepB与己公布的质粒复制相关蛋白同源性制作系统发育树。
由植物乳杆菌质粒复制相关蛋白同源性的系统进化树可知，推测pLP3质粒属于植物乳杆菌编码Rep质粒家族1。Rep-1蛋白家族质粒和质粒pC194的Rep均含有3 个保守的Motifs，而且Motifs已被证明是pC194家族质粒复制起始的关键。经过对pLP3质粒序列分析，发现该质粒的sso、dso位点以及Rep蛋白的Motifs与pC194家族的特征吻合。因此，推定pLP3的复制方式为滚环复制，属于pC194家族。
四、穿梭载体的构建及其宿主范围、转化效率和稳定性
以克隆载体pUC19为模板，用引物pUC19-F/R扩增pUC19质粒上的大肠杆菌复制子Ori的DNA片段。以pSCPSP质粒为模板，用引物CmR-F/R扩增pSCPSP质粒上的氯霉素抗性基因CmR片段。用SOE-PCR将Ori片段与CmR片段连接构成OCR片段，利用PshAI、NheI两个限制性内切酶将OCR片段融合在pLP3质粒载体上，将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取转化子酶切验证得到正确的重组质粒，命名为D-pLP3。
为确定穿梭质粒D-pLP3的宿主范围，将穿梭质粒电转化至各种乳酸菌感受态细胞内，并计算其在各种乳酸菌的转化效率和质粒的稳定性。结果显示，穿梭质粒D-pLP3均可在植物乳杆菌LP1和LP3、鼠李糖杆菌R1等乳酸杆菌和乳酸乳球菌NZ9000内成功电转，获得相应的转化子。但在发酵乳杆菌G1、戊糖片球菌ZQ4未能获得重组质粒的转化子。穿梭质粒转化效率介于0.3×102～1.0×103 CFU/μg（DNA质量计）之间，比普通的乳酸菌质粒转化效率略低。
重组质粒在植物乳杆菌LP1、LP3的宿主菌的丢失率约为30%，在乳酸乳球菌NZ9000中丢失率为37%。重组质粒在鼠李糖杆菌R1中经过60 代连续传代培养后，重组质粒丢失率几乎达到100%。重组质粒D-pLP3在不同乳酸菌感受态细胞电转化效率和质粒稳定性的差异，可能与质粒不相容性有关。
五、表达质粒构建和荧光蛋白检测结果
本实验设计3 对引物分别PCR扩增嗜酸乳杆菌S层蛋白的slpA启动子、Sig信号肽、pMG36e上的转录终止子，根据SOE-PCR的原理将3 个外源基因表达原件，克隆至穿梭质粒D-pLP3，成功构建乳酸菌表达质粒D-pLP3-PslpA（图6）。依据eGFP蛋白能在蓝光的激发下显示绿色荧光的特性，因此，选eGFP蛋白作为表达质粒的靶标蛋白。
重组质粒D-pLP3-PslpA-eGFP电转至植物乳杆菌，挑取转化后的阳性重组菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1和空载体D-pLP3-LP1接种于MRS液体培养基培养过夜，先取16 h重组植物乳杆菌的菌体进行荧光显微镜观察，在蓝光激发下，可以观察到绿色荧光（图7）。然后取24 h重组植物乳杆菌的表达上清液，经60%硫酸铵沉淀后100 倍浓缩，SDS-PAGE分析。与空载体D-pLP3-LP1的重组菌相比较，重组菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1的培养上清液可见27 kDa左右的目的条带（图8）。说明重组菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1已成功电转至植物乳杆菌LP1中，信号肽Sig能够将eGFP蛋白成功分泌到胞外。
讨 论
本研究从分离自传统发酵酸菜中的植物乳杆菌LP3中得到一个天然质粒pLP3，该质粒大小为2 017 bp，GC含量为37.48%。进一步通过生物信息学分析质粒pLP3，该质粒编码7 个ORF，其中ORF3（317 个氨基酸）为复制起始蛋白（RepA），ORF5（48 个氨基酸）编码一个未知功能的蛋白。其余ORF在GenBank没有与之相匹配的蛋白，因此质粒pLP3应归为隐蔽性质粒。根据Rep蛋白的同源性，及其该质粒的sso、dso位点以及Rep蛋白的Motifs与pC194家族进行比较，发现与pC194家族的特征相吻合，推测该质粒的复制方式为滚环复制，属于pC194家族。
