目前对于如何阻断腌肉制品中N-亚硝胺的形成，主要从原料选择、加工方式、外源添加物（抗坏血酸钠、VE、茶多酚等）等方面进行控制。利用微生物发酵技术（特别是益生菌发酵）降低肉制品中N-亚硝胺的形成是值得深入探究的课题。然而，目前发酵剂种类和不同的发酵时间对肉制品中N-亚硝胺的抑制效果方面的研究报道还较少。
天津农学院食品科学与生物工程学院的李秀明、马俪珍*和天津农学院动物科学与动物医学学院杨华等人将发酵技术引入传统红肠的加工工艺中，在肉馅中分别接种4 种常应用于发酵肉制品的商业复合乳酸菌发酵剂和经筛选得到的3 株可降低发酵风干肠中N-亚硝胺的乳酸菌单菌，发酵不同的时间，经过熟制得到发酵红肠新产品。通过对产品的感官评定、pH值、乳酸菌数、亚硝酸盐、生物胺和N-亚硝胺等相关指标的测定，同时与空白对照组对比，分析乳酸菌发酵剂及发酵时间对发酵红肠安全品质的影响，也为乳酸菌发酵剂在食品中的应用提供了理论参考依据。
1. 发酵12 h的7 组红肠成品与CK组感官评价结果
发酵红肠加工中，经接种7 种发酵剂，并发酵不同时间，发现随着发酵时间的延长（12 h→24 h），发酵红肠的气味及滋味明显变差，发酵16 h及以上产生明显的酸味且不被感官评价者所接受，因此本研究仅对发酵至第12小时的不同发酵红肠产品进行感官评定。
结果显示，8 组红肠产品感官评价由好到差依次为：SHI-59＞CK＞ Lc＞Ls＞Lp＞WBX-43＞PRO-MIX5＞VBM-60。其中SHI-59组发酵红肠感官更容易被人接受，该组发酵红肠口感微酸、有发酵香味、无异味、切片性良好、发色正常、滋味较好，接受度较高。VBM-60组则口感偏酸，发酵异味感较重，接受度较低。造成不同组口感区别的原因可能是由于不同乳酸菌发酵剂活力存在差异，虽在同一发酵时间，但不同组发酵程度不同；且发酵剂菌种组成不同，可能是由于发酵产生的代谢产物如香味、滋味等成分存在较大差异。
2. 不同乳酸菌复配组在发酵的不同时间点乳酸菌数动态变化
结果显示，在发酵至第12小时，PRO-MIX5和VBM-60两组的乳酸菌总数分别达到8.64（lg（CFU/g））和8.40（lg（CFU/g）），菌活性较强，而其他各组乳酸菌数均在5.16～6.79（lg（CFU/g））范围。随着发酵时间延长，各组乳酸菌数整体呈上升趋势，但SHI-59组、VBM-60组、Ls组在发酵20 h后乳酸菌数有所下降。Lc和Lp组在发酵12～24 h期间乳酸菌数呈缓慢上升趋势，且均显着低于其他组（P＜0.05），说明这两组发酵剂活力低或不适宜在这一体系中生长。
不同乳酸菌发酵剂活力不同，进入衰亡期的时间以及最大菌活力也有所差异，如WBX-43组在发酵至第20小时乳酸菌数已达到9.04（lg（CFU/g）），显着高于其他各组（P＜0.05）。由此可见，不同的乳酸菌发酵剂具有不同的活力，其在不同发酵时间菌数的增长速度以及生长特性亦有较大差异，因此筛选在红肠肉馅体系中适宜生长的发酵剂显得尤为重要。
3. 不同乳酸菌复配组红肠成品的pH值随不同发酵时间的变化
如图1所示，各组pH值均随着发酵时间的延长呈降低趋势，其中PRO-MIX5和VBM-60组的pH值显着低于其他5 组（P＜0.05），在发酵至第12小时，pH值分别为5.24和5.34，与表3中乳酸菌数变化趋势一致，这是由于这两组乳酸菌数增长较快，生成的乳酸量。本实验测得CK组pH值为6.4，WBX-43、SHI-59、Lc、Lp、Ls在发酵至第12小时pH值差异不显着，且均略低于CK组，当发酵至第16小时，5 组之间的pH值显示出显着差异（P＜0.05），这种趋势一直保持到发酵24 h，此时5 组pH值下降程度由大到小顺序依次为：WBX-43＞Ls＞SHI-59＞Lc＞Lp，这与乳酸菌发酵剂的产酸能力和活力有关。
4. 不同乳酸菌复配组红肠成品的硝酸钠和亚硝酸钠随不同发酵时间的变化
7 组发酵红肠的硝酸钠和亚硝酸钠随不同发酵时间的变化见图2。CK组亚硝酸钠含量为41.63mg/kg，从图2A可以看出，PRO-MIX5和VBM-60组在第12小时亚硝酸钠含量明显低于其他5 组，其含量分别为7.58 mg/kg和11.01 mg/kg，且随发酵时间延长，亚硝酸钠残留量变化不显着（P＞0.05）；其他5 组亚硝酸钠残留量随发酵时间延长整体呈不同程度的下降趋势。
本实验测得CK组中硝酸钠含量为161.00 mg/kg，由图2B可以看出，随着发酵时间的延长，各组发酵红肠中硝酸盐含量呈降低趋势，说明接菌发酵后可降低发酵红肠中硝酸盐含量，但整体测得的含量相对较高，均在90 mg/kg以上。其中VBM-60组在发酵12 h即能够较好地降低硝酸盐含量，这可能是由于该组发酵菌活力相对较强，产生了一些可降解硝酸盐的还原酶，被菌体本身生长所利用，亦有可能被转化为含氮物质与胺类结合形成N-亚硝胺。
5. 不同乳酸菌复配组红肠成品的生物胺含量随不同发酵时间的变化
结果显示，随着发酵时间的延长，各组发酵红肠中8 种生物胺含量在逐渐增多；且生物胺作为细胞生长过程中重要的物质，总生物胺也会随乳酸菌数增长而增多。实验发现，各组发酵红肠在不同发酵时间均检测出腐胺和精胺，发酵12～20 h，各组红肠中所产生的腐胺和精胺含量呈缓慢增长趋势，而在20～24 h之间变化不显着（P＞0.05）。在发酵至第12小时，Lc和Ls组两组除腐胺和精胺外，还检测出尸胺和酪胺，腐胺和尸胺作为一种二胺，能够和亚硝酸盐反应生成强致癌物N-亚硝胺，常见的生物胺中以组胺毒性最大，其次是酪胺，因此相比之下用Lc和Ls发酵的红肠产品安全品质相对较低。
随着发酵时间延长，脱羧酶活性不断增强，发酵红肠中生物胺种类逐渐增多，且含量明显增加，如苯乙胺、尸胺、酪胺。Lc组尸胺含量随着发酵时间的延长呈明显上升趋势，且由于各组乳酸菌发酵剂的特性不同，其他各组也在不同发酵时间产生了一定量的酪胺。值得注意的是在发酵至第24小时，VBM-60、Lc和Lp组中产生了组胺。虽然其含量并未超过一些标准规定，但是此时各组发酵红肠生物胺含量均较高。因此相比之下发酵时间以12 h为好，此时Lp组腐胺（144.50mg/kg）和精胺含量（57.32 mg/kg）、Ls组精胺含量（59.14 mg/kg）显着低于CK组（腐胺：181.25 mg/kg；精胺：129.09 mg/kg）（P＜0.05），其中Lp组总生物胺含量（201.81mg/kg）显着低于其他各组（P＜0.05），结合乳酸菌数变化。相较于CK组，SHI-59、 PRO-MIX5、VBM-60、Ls组与CK组8 种生物胺的总含量之间差异不显着（P＞0.05）。
6. 不同乳酸菌复配组红肠成品的N-亚硝胺含量随不同发酵时间的变化
结果显示，随着发酵时间延长，除PRO-MIX5和Lc组外，各组红肠所含N-亚硝胺总量呈逐渐降低趋势。发酵至第12小时，PRO-MIX5和Lc组中N-亚硝胺总量显着低于CK组，经短时间发酵即可起到降低产品中N-亚硝胺的作用。在随后发酵16～24 h范围时，除发酵至第16小时的SHI-59、PRO-MIX5、Lp组和发酵至第20小时的PRO-MIX5组外，其余各时间点的各组发酵红肠所含N-亚硝胺总量均显着低于CK组（P＜0.05）；特别是当发酵至第24小时，各组N-亚硝胺总量均显着下降，抑制效果十分显着。
目前国标仅限量肉制品中NDMA含量为3 μg/kg，本实验中CK组中NDMA含量为5.15 μg/kg，超过了国家限量标准。经接菌发酵后，部分乳酸菌发酵剂可抑制NDMA的形成，且发酵剂的组成不同，活性也有差异，因此在不同发酵时间NDMA含量动态变化趋势区别较大。结果显示，WBX-43、Lp组中NDMA含量随着发酵时间的延长呈显着降低趋势，Ls组在发酵12～20 h，NDMA含量呈显着降低趋势，但在发酵后期至第24小时，NDMA含量有所升高；VBM-60组在发酵过程中NDMA含量相较于其他发酵组整体较低；Lc组则除发酵至第20小时有所升高，其他发酵时间点均较低，说明在应用该种发酵剂降解NDMA时，需控制一定的发酵时间才可达到较好的效果；SHI-59、PRO-MIX5两组中的NDMA则呈先增长后降低的趋势。因此对于抑制NDMA效果来看，PROMIX5、VBM-60和Lc组相对于其他各组可在较短发酵时间内降低NDMA形成，分别使NDMA含量降低至2.91、0.77、1.08 μg/kg。
对于除NDMA以外的其他8 种N-亚硝胺，目前无国标规定限量。相比CK组，除发酵至第12、16小时的VBM-60组和发酵至第16小时的SHI-59组外，各发酵组在各个发酵时间对NMEA均有抑制效果；对于NDEA，除发酵至第12小时的SHI-59和Ls组，其余各发酵时间的各组均能显着降低NDEA含量。在发酵至第24小时，7 种乳酸菌发酵剂发酵的红肠中NDBA均显着低于CK组，这说明长时间的发酵可降低NDBA的含量；对于NPIP，SHI-59组对其抑制呈现较强规律性，随发酵时间的延长，在16～24 h，逐渐降低了该组发酵红肠中的NPIP含量；而对于NPYR和NDPheA，各个发酵组在不同发酵时间的含量并未呈现较强规律性。相反，接种乳酸菌发酵后对NDPA、NMOR的生成并未起到抑制效果，反而具有一定的促进作用。
结合以上分析结果，虽然整体呈现发酵时间越长，N-亚硝胺含量越低的趋势，其中PRO-MIX5和Lc两种发酵剂在短时间内即可起到显着降低9 种N-亚硝胺总量的效果；对于国标中有限定标准的NDMA，PRO-MIX5、Lc和Lp三种发酵剂在发酵至第12小时已达到较好的抑制效果，应用效果好。
讨 论
根据以上各项指标结果进行综合分析，随着发酵时间的延长，各组乳酸菌数以不同速度增长，8 种生物胺含量逐渐升高，pH值、亚硝酸盐和硝酸盐残留量则呈降低趋势，其中硝酸盐残留量整体在90～169 mg/kg之间，硝酸盐主要表现为亚硝酸盐毒性，但会受到口腔中的硝酸盐还原酶和病理状态下胃液中的硝酸盐还原菌作用转化为亚硝酸盐，本研究经乳酸菌发酵后，硝酸盐残留量适度下降，一定程度地提高了产品安全性。本研究发现各发酵组红肠中9 种N-亚硝胺含量随着发酵时间延长均呈降低趋势。但发酵时间越长，会使得一些生物胺含量增加，过量时会导致呕吐、呼吸困难等症状；且对于本无发酵工艺的红肠来说，长时间的发酵对风味破坏严重，口感偏酸，不能够被品评者接受，因此选择适度发酵12 h为佳。
本研究所筛选的7 种乳酸菌发酵剂中，其中 PRO-MIX5和VBM-60两种乳酸菌活力最强，产酸能力、亚硝酸盐的降解速度均显着优于其他各组，两种发酵剂在适度发酵至第12小时即可显着降低9 种N-亚硝胺含量，且PRO-MIX5组中8 种生物胺总量与CK组差异不显着。综合来看，PRO-MIX5提高红肠产品安全品质应用效果较好。对于增加发酵技术的红肠的口感，还需进行一定的消费引导，或在后期进一步深入研究，提取乳酸菌增长所产生的能够抑制N-亚硝胺的物质，直接添加至肉馅中，以达到既提高产品品质又不影响产品风味的效果，甚至可应用于其他肉制品中，将会有更实际的应用价值。
结 论
本研究结果表明，使用PRO-MIX5乳酸菌发酵剂接种至红肠肉馅中，经发酵12 h，乳酸菌数达到 8.64（lg（CFU/g）），可显着降低9 种N-亚硝胺总量至8.68 μg/kg，降低NDMA至3.07 μg/kg；红肠pH值为5.24；显着降低亚硝酸盐残留量至7.58 mg/kg，硝酸盐含量为141.84 mg/kg；8 种生物胺总量为320.15 mg/kg，且与CK组差异不显着。该种发酵剂相比其他6 种能够显着提高发酵红肠的安全品质，也为制作新型发酵红肠提供了理论指导。
